陽(yáng)梅英，姜云惠，陳素冰，徐 華，袁小星，唐雄志

子宮頸癌是全球女性常見(jiàn)的癌癥之一，相應(yīng)的篩查方法已發(fā)展了近半個(gè)世紀(jì)。目前，HPV和細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測(cè)仍是大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家主要的篩查方法[1]。2015年以來(lái)，發(fā)達(dá)國(guó)家已逐步將HPV檢測(cè)作為一種具有靈活細(xì)胞學(xué)檢測(cè)功能的初級(jí)篩查工具，以提供更強(qiáng)的基于風(fēng)險(xiǎn)的分層效應(yīng)。大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家的細(xì)胞學(xué)篩查結(jié)果質(zhì)量不高[2]，但是可重復(fù)的HPV檢測(cè)可減少細(xì)胞學(xué)專家主觀判斷導(dǎo)致的診斷失敗。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞學(xué)檢查存在不足，從而降低了篩查的特異性[3]。因此，尋找子宮頸病變發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物，應(yīng)用于子宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，是提高子宮頸病變?cè)缙谠\斷能力的關(guān)鍵。高遷移率組A2基因HMGA2是一種非組蛋白和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，作為癌胎蛋白，HMGA2在發(fā)育過(guò)程中起重要作用。有研究顯示，HMGA2是HPV整合熱點(diǎn)之一[4]，在子宮頸癌的發(fā)生中起一定作用。本文檢測(cè)子宮頸脫落細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)，分析其在子宮頸病變中的篩查意義。

1 材料與方法

1.1 材料選取2016年4～7月中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院婦科門診及住院收治的可追蹤的HPV陽(yáng)性子宮頸標(biāo)本143例，患者均行子宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查，年齡22～68歲，中位數(shù)(41.5±4.8)歲。其中無(wú)子宮頸上皮內(nèi)病變41例(陰性組)，意義不明確的非典型性鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)28例，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)27例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)33例，鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)14例。

1.2 方法采用刷取患者的標(biāo)本完成液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)后，殘余標(biāo)本涂片至多聚賴氨酸包被的載玻片上，干片后采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HMGA2蛋白在子宮頸各級(jí)病變脫落細(xì)胞中的表達(dá)。鼠抗人HMGA2單克隆抗體購(gòu)于上海瑞齊公司，免疫組化試劑盒(EnVision兩步法)及DAB顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新公司，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以子宮頸脫落細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)均陰性的細(xì)胞標(biāo)本為陰性對(duì)照，組織病理學(xué)陽(yáng)性的組織標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。所有患者均隨訪24個(gè)月。

1.3 結(jié)果判斷HMGA2蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色的陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色或棕褐色彌漫顆粒狀。每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(400×)，判斷是否有HMGA2蛋白顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用受試者操作(ROC)曲線統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGA2蛋白的表達(dá)不同級(jí)別細(xì)胞學(xué)診斷的鏡下表現(xiàn)詳見(jiàn)圖1。HMGA2蛋白在陰性組中的陽(yáng)性率為19.5%，在ASC-US組中陽(yáng)性率為45.8%，從LSIL組中的70.4%上升到HSIL組中的87.9%，在SCC組中則高達(dá)92.9%(表1，圖2)。HMGA2蛋白表達(dá)與子宮頸病變惡性程度相關(guān)，陽(yáng)性率隨著子宮頸病變程度的增加而增加。

2.2 HMGA2蛋白的表達(dá)效能本組患者隨訪24個(gè)月，至少行1次組織學(xué)檢查≥子宮頸上皮內(nèi)病變1級(jí)定義為隨訪組織學(xué)陽(yáng)性。結(jié)果顯示：HMGA2蛋白表達(dá)對(duì)隨訪組織學(xué)陽(yáng)性的預(yù)測(cè)能力優(yōu)于單純的細(xì)胞學(xué)涂片(表2)。預(yù)測(cè)隨訪組織學(xué)結(jié)果時(shí)，細(xì)胞學(xué)的敏感性為80.4%，HMGA2蛋白的敏感性為90.5%，而細(xì)胞學(xué)的特異性為83.5%，低于HMGA2蛋白的特異性(91.2%)。HMGA2蛋白檢測(cè)的ROC曲線下面積0.938高于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的ROC曲線下面積0.804(P<0.001)，提示HMGA2蛋白檢測(cè)預(yù)測(cè)隨訪組織學(xué)陽(yáng)性的檢驗(yàn)效能高于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(表3)。

表1 HMGA2蛋白在不同子宮頸病變組織中的表達(dá)[n(%)]

ASC-US.不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞；LSIL.低級(jí)別上皮內(nèi)病變；HSIL.高級(jí)別上皮內(nèi)病變；SCC.鱗狀細(xì)胞癌

表2 不同子宮頸病變HPV陽(yáng)性患者子宮頸脫落細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)及隨訪

ASC-US.不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞；LSIL.低級(jí)別上皮內(nèi)病變；HSIL.高級(jí)別上皮內(nèi)病變；SCC.鱗狀細(xì)胞癌；*在隨訪的24個(gè)月中，至少進(jìn)行1次組織學(xué)檢查≥子宮頸上皮內(nèi)病變1級(jí)

表3 HMGA2表達(dá)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在預(yù)測(cè)隨訪組織學(xué)結(jié)果時(shí)的檢驗(yàn)效能

3 討論

子宮頸細(xì)胞是一種方便可靠的材料來(lái)源，這促使臨床研究改進(jìn)子宮頸癌的篩查策略。HPV篩查是必要的，但不是子宮頸癌發(fā)展的唯一決定性因素，因此越來(lái)越多的篩查方法開始關(guān)注腫瘤發(fā)生過(guò)程中的分子改變。如p16/Ki-67和microRNAs在提高HPV陽(yáng)性分型效應(yīng)的敏感性和特異性有廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)于這些分子生物學(xué)標(biāo)志物，在形態(tài)轉(zhuǎn)化前可能發(fā)生相對(duì)變化，是比PAP試驗(yàn)更好的指標(biāo)來(lái)區(qū)分HPV陽(yáng)性患者。本實(shí)驗(yàn)選擇熱整合基因HMGA2，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估它的分類效果。ROC分析表明，HMGA2的半定量免疫染色值比TCT檢測(cè)值更高，能夠區(qū)分HPV陽(yáng)性患者的腫瘤變乃至癌變的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

HPV整合是相關(guān)癌變的一個(gè)功能步驟，在人類基因組的早期階段可能會(huì)隨機(jī)分散[6]。然而，整合熱點(diǎn)為病毒的長(zhǎng)期生存和選擇提供優(yōu)勢(shì)，使其成為侵襲性子宮頸癌的主要事件。這些病毒利益整合熱點(diǎn)的致癌機(jī)制，是由于腫瘤抑制因子的下調(diào)或癌基因的上調(diào)所致。因此，HMGA2基因檢測(cè)可用于HPV轉(zhuǎn)化感染的預(yù)測(cè)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持將免疫細(xì)胞化學(xué)染色作為分類的方法。越來(lái)越多的分子檢測(cè)HPV整合的熱點(diǎn)值得進(jìn)一步研究[7]。

圖1HPV陽(yáng)性患者不同子宮頸病變的細(xì)胞學(xué)診斷：A.陰性組；B.不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞；C.低級(jí)別上皮內(nèi)病變；D.高級(jí)別上皮內(nèi)病變；E.鱗狀細(xì)胞癌圖2HMGA2蛋白在HPV陽(yáng)性患者不同子宮頸脫落細(xì)胞的表達(dá)：A.陰性組；B.不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞；C.低級(jí)別上皮內(nèi)病變；D.高級(jí)別上皮內(nèi)病變；E.鱗狀細(xì)胞癌，EnVision兩步法

HMGA2在胚胎發(fā)生過(guò)程中對(duì)DNA活性的調(diào)控起重要作用，但在成體細(xì)胞中卻未能檢測(cè)到。HMG家族通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化、衰老和死亡[8]。根據(jù)本組前期報(bào)道[4]，HMGA2的頻率為7.8%，是新的HPV整合熱點(diǎn)之一，同時(shí)在子宮頸癌組織中也有明顯的上調(diào)。最近有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)HMGA2在子宮頸上皮內(nèi)病變和子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，與HPV16拷貝數(shù)相比，其更有診斷價(jià)值，具體機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，HMGA2高表達(dá)與胃腸道腫瘤、乳腺癌、口腔癌、肺癌和卵巢癌等多種癌癥的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)143例HPV陽(yáng)性患者子宮頸脫落細(xì)胞的HMGA2蛋白表達(dá)，并隨訪24個(gè)月，結(jié)果顯示HMGA2蛋白表達(dá)與子宮頸病變有關(guān)，其陽(yáng)性率及其強(qiáng)度隨著子宮頸病變程度的增加而增加，敏感性為90.5%，特異性為91.2%，其對(duì)組織學(xué)陽(yáng)性的檢驗(yàn)效能明顯高于單純的細(xì)胞學(xué)涂片。HMGA2蛋白過(guò)表達(dá)在子宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮非常重要作用，有利于子宮頸病變的早期診斷，可作為子宮頸癌篩查的新分子標(biāo)志物。