郭 燕，衛(wèi)穎澤，陳旭東，陳亞麗，陸曉云

胰腺癌病死率在西方國(guó)家惡性腫瘤中的占比較高[1]，我國(guó)胰腺癌每年發(fā)病率和病死率也逐年上升[2]。胰腺癌在發(fā)展初期通常無(wú)癥狀，由于發(fā)現(xiàn)晚、生存率低，尋找新生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)胰腺癌的早期診斷及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1, Trap1)是熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)家族的分子伴侶，主要定位于線粒體。目前，Trap1在結(jié)腸癌[3]、胃癌[4]及食管癌[5]中的表達(dá)及臨床意義已有報(bào)道，而Trap1在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)免疫組化PV 9000兩步法檢測(cè)Trap1在74例胰腺癌中的表達(dá)，分析Trap1與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2006年1月～2018年12月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院74例胰腺癌住院患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常胰腺組織和正常胰泡組織。

1.2 試劑與方法

1.2.1主要試劑 小鼠單克隆Trap1抗體(1 ∶100)、一抗稀釋液、PBS及PV 9000兩步法，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2免疫組化法 將4 μm厚的石蠟切片置于65 ℃溫箱烤片中過(guò)夜，二甲苯常規(guī)脫蠟，依次經(jīng)100%、95%、75%乙醇去除多余液體，蒸餾水沖洗后，切片使用枸櫞酸鹽緩沖液經(jīng)高壓修復(fù)，3% H2O2室溫下孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加一抗100 μL，室溫下孵育1 h，滴加100 μL反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育20 min，滴加100 μL二抗(增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，室溫下孵育20 min，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。為證明Trap1抗體免疫組化檢測(cè)的特異性，選用Trap1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性染色的切片，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀切片由兩名病理科副主任及副主任以上醫(yī)師獨(dú)立完成，Trap1以細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性；p53以細(xì)胞核中呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：1%～5%為1分，5%～30%為2分，31%～60%為3分，>61%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為不表達(dá)，1～2分為低表達(dá)，3～6分為中等表達(dá)，>6分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢測(cè)各組間Trap1的表達(dá)差異，采用Kaplan-Meier法檢測(cè)Trap1與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Trap1在胰腺癌組織中的表達(dá)Trap1在胰腺癌組織中有10例不表達(dá)、12例低表達(dá)、23例中等表達(dá)、29例高表達(dá)；在對(duì)應(yīng)的癌旁正常胰腺導(dǎo)管組織中均不表達(dá)；在正常腺泡組織中均低表達(dá)(圖1)，胰腺癌組織中Trap1的表達(dá)明顯高于正常胰腺導(dǎo)管和腺泡組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 Trap1表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系Trap1高表達(dá)與胰腺癌分化程度(圖2)及腫瘤大小密切相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、浸潤(rùn)深度、發(fā)病部位及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓無(wú)明顯相關(guān)性(表2)。

①A①B①C①D②A②B②C②D②E②F圖1 A.胰腺癌組織:由大小不等、不規(guī)則的異型腺體構(gòu)成;B.胰腺癌組織中Trap1低表達(dá);C.癌旁正常導(dǎo)管和腺泡組織:由規(guī)則的、無(wú)異型的導(dǎo)管和腺泡組成;D.癌旁正常導(dǎo)管(黑色箭頭)和腺泡組織(紅色箭頭)中Trap1不表達(dá)和低表達(dá),PV9000兩步法 圖2 A.胰腺高分化腺癌組織:由分化良好、不規(guī)則的異型腺體構(gòu)成;B.Trap1在胰腺高分化腺癌組織中的低表達(dá),PV9000兩步法;C.胰腺中分化腺癌組織:由中等大小導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)及大小形狀各異的小腺管樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成;D.Trap1在胰腺中分化腺癌組織中的中等表達(dá),PV9000兩步法;E.胰腺低分化腺癌組織:由密集排列的實(shí)性巢狀或條索狀結(jié)構(gòu)和形狀不規(guī)則的小腺體混合構(gòu)成;F.Trap1在低分化腺癌組織中高表達(dá),PV9000兩步法

表1 胰腺癌、癌旁組織及正常胰泡組織中Trap1的表達(dá)

2.3 Trap1表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪64例胰腺癌患者，存活13例，死亡51例。Trap1不表達(dá)7例，平均生存時(shí)間22.9個(gè)月。Trap1低表達(dá)12例，平均生存時(shí)間18.7個(gè)月。Trap1中表達(dá)20例，平均生存時(shí)間20個(gè)月。Trap1高表達(dá)25例，平均生存時(shí)間19.2個(gè)月。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，胰腺癌患者生存期與Trap1表達(dá)差異無(wú)顯著性(P>0.05，圖3)。

2.4 p53與Trap1表達(dá)的相關(guān)性p53在74例胰腺癌中均有不同程度的表達(dá)；在正常胰腺腺泡和正常胰腺導(dǎo)管組織中均不表達(dá)。在74例胰腺癌中，p53低表達(dá)29例，中+高表達(dá)45例。Trap1不表達(dá)和低表達(dá)22例，中+高表達(dá)52例。結(jié)果顯示：p53和Trap1表達(dá)呈正相關(guān)性(P<0.05，表3)。

圖3 Trap1表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

表2 胰腺癌臨床病理特征與Trap1表達(dá)的關(guān)系

表3 p53、Trap1表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

Trap1最初通過(guò)酵母雙雜交篩選確定為Ⅰ型腫瘤壞死因子受體蛋白，且cDNA測(cè)序分析顯示，Trap1與熱休克蛋白家族成員HSP75相同，與HSP90高度相似，與細(xì)胞質(zhì)HSP90具有26%相同性和45%相似性，Trap1主要定位于線粒體，故稱為線粒體HSP90。Trap1可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體過(guò)渡孔，維持細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)，繼而成為線粒體活性氧的清道夫[6-7]。因此，研究者發(fā)現(xiàn)Trap1在多種腫瘤中導(dǎo)致抗腫瘤藥物的耐受，包括卵巢癌[8]、結(jié)直腸癌[9]和乳腺癌細(xì)胞[10-11]。

Trap1在多種惡性腫瘤[3-5,12]中表達(dá)增高，且與臨床病理特征有關(guān)。本組發(fā)現(xiàn)Trap1在74例胰腺癌中表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁正常導(dǎo)管和腺泡組織，且Trap1表達(dá)與胰腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)。在卵巢癌和惡性膠質(zhì)瘤[3]中Trap1的表達(dá)也與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)，而在乳腺癌[13]中Trap1表達(dá)與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)。此外，本組發(fā)現(xiàn)Trap1表達(dá)與胰腺癌的大小呈正相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌[12]中Trap1的表達(dá)與腫瘤大小呈正相關(guān)性，與本組結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)表明Trap1表達(dá)水平與胰腺癌的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性，可能與胰腺癌的預(yù)后較差有關(guān)，胰腺癌患者存活病例數(shù)較少。在其他惡性腫瘤[3]中如肺癌、惡性膠質(zhì)瘤、腎癌、結(jié)直腸癌和食管癌[5]中，Trap1的表達(dá)可作為獨(dú)立預(yù)后因素，Trap1高表達(dá)提示腫瘤患者預(yù)后差。乳腺癌細(xì)胞中Trap1過(guò)表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯下降，過(guò)表達(dá)Trap1的乳腺癌細(xì)胞株MAD-MB-231尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，裸鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯低于對(duì)照組，Trap1增高可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[13]，該結(jié)果表明Trap1的高表達(dá)可能提示乳腺癌患者預(yù)后較好。Trap1表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

p53是人類癌癥中突變最頻繁的基因，其突變導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，進(jìn)而引起增殖異常和惡性轉(zhuǎn)化[14]，在胰腺癌發(fā)生過(guò)程中癌基因K-ras及抑癌基因p53、p16和DPC4/SAMD4發(fā)揮重要作用[15]。p53在大部分胰腺癌組織中均可檢測(cè)到，本組采用免疫組化PV 9000兩步法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53在胰腺癌中均不同程度的表達(dá)，其中中等及高表達(dá)率達(dá)60.8%，并分析p53與Trap1的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)性，提示p53在胰腺癌中的作用可能與Trap1有關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明Trap1在胰腺癌發(fā)生中的重要作用，可作為胰腺癌診斷的分子指標(biāo)。Trap1在低分化的胰腺癌中表達(dá)明顯增高，有望作為治療低分化胰腺癌的分子靶點(diǎn)。