方長(zhǎng)清，丁春曉，劉小虎，王 健，張 恒， 杜 江， 李建華

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，每年肺癌位居惡性腫瘤新發(fā)病例的首位，在女性中位居第2位[1]。在其他國(guó)家，肺癌是美國(guó)癌癥死亡的首要原因，早期肺癌患者行手術(shù)切除治療預(yù)后較好，但該病通常早期無(wú)癥狀直到進(jìn)展為晚期[2]。而在晚期患者中，肺癌組織往往會(huì)侵及周圍組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，當(dāng)腫瘤侵犯胸膜時(shí)常常引起惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)，甚至為血性，進(jìn)而導(dǎo)致患者臨床上出現(xiàn)氣促等癥狀，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)肺癌并有效控制早期肺癌的惡性進(jìn)展是亟待解決的問題。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的絕大部分，組織學(xué)類型包括腺癌、鱗癌及少見的大細(xì)胞肺癌等[3]。NSCLC一般早期癥狀不明顯或僅出現(xiàn)非特異性的臨床癥狀，因此患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期。既往大量活檢組織學(xué)研究證明，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與其密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討MPE中NSCLC的相關(guān)EMT免疫表型，即從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)一步論證EMT與肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2017年1月～2018年12月存檔的胸水標(biāo)本823例。其中女性423例，年齡56～78歲，中位年齡67歲；男性400例，年齡50～87歲，中位年齡72歲。對(duì)胸水標(biāo)本診斷結(jié)果為可疑陽(yáng)性及異性增生細(xì)胞進(jìn)行離心沉渣包埋，行HE及免疫組化染色，通過病理診斷得到107例NSCLC胸水沉渣標(biāo)本，該107例通過回訪追蹤，獲得完整的臨床資料。其中男性61例，中位年齡68歲；女性46例，中位年齡71歲。

1.2 試劑鼠抗人E-cadherin、N-cadherin單克隆抗體，兔抗人vimentin、β-catentin單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司銷售的美國(guó)Biox公司產(chǎn)品。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 液基細(xì)胞薄層檢測(cè)(thinprep cytology test, TCT)收集新鮮胸水20 mL左右，室溫下800 r/min離心5 min，棄去上清，取沉淀底層細(xì)胞，加入清洗液后再次離心，取沉淀與保存液混合后機(jī)器自動(dòng)制片，手動(dòng)中性樹膠封固。

1.4 胸水沉渣包埋采用TCT常規(guī)制片、診斷后，每份對(duì)應(yīng)標(biāo)本收集新鮮胸水200 mL左右，經(jīng)95%乙醇固定24 h后石蠟包埋、切片。

1.5 免疫組化免疫組化染色采用SP法，PBS緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.6 結(jié)果判定E-cadherin、N-cadherin陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，vimentin陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，β-catentin陽(yáng)性正常定位于細(xì)胞膜。在NSCLC細(xì)胞中，由于發(fā)生EMT，β-catentin膜表達(dá)減弱，胞質(zhì)積聚或核異常積聚，所以在本實(shí)驗(yàn)中，β-catentin判讀標(biāo)準(zhǔn)是非胞膜表達(dá)的異常陽(yáng)性。陽(yáng)性程度判斷：細(xì)胞無(wú)陽(yáng)性著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%為(+)，26%～50%為()，≥51%為()；以(+～)為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400×)，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC病例的獲得本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以下幾方面對(duì)NSCLC做出最終診斷：收集的823例胸水標(biāo)本中，對(duì)TCT檢查結(jié)果為可疑陽(yáng)性或細(xì)胞異型增生的標(biāo)本進(jìn)行胸水標(biāo)本沉渣包埋，進(jìn)而行免疫組化染色，肺腺癌TTF-1、Napsin A、CK7等抗體陽(yáng)性，肺鱗癌CK5/6、p40、p63、CK34βE12等抗體陽(yáng)性，同時(shí)針對(duì)具體病例，應(yīng)用多抗體進(jìn)行鑒別診斷，如應(yīng)用CR、MC、CK5/6、WT-1、EGFR、D2-40等抗體鑒診NSCLC與惡性間皮瘤[4]；應(yīng)用CK20、CDX2等抗體鑒別肺腺癌與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌；應(yīng)用ER、PR等鑒診肺腺癌與轉(zhuǎn)移性乳腺癌等。最后結(jié)合患者的臨床癥狀與體征，如發(fā)病誘因(吸煙、職業(yè)和環(huán)境接觸史、電離輻射、既往肺部感染、遺傳因素等)、臨床表現(xiàn)(胸部脹痛、痰血、低熱、咳嗽等)、胸部X光片、支氣管鏡細(xì)胞學(xué)檢查及術(shù)后組織學(xué)病理檢查，最終確診107例NSCLC作為研究病例。

2.2 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達(dá)E-cadherin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組中的陽(yáng)性率分別為28.21%(11/39)、33.34%(11/33)，均顯著低于NSCLC癌旁組織組(91.43%，32/35)(P<0.05，表1)。N-cadherin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組中的陽(yáng)性率分別為53.85%(21/39)、57.58%(19/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(14.29%，5/35)(P<0.05，表1)。β-catentin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組中的異常陽(yáng)性率分別為79.49%(31/39)、84.85%(28/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。vimentin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組中的陽(yáng)性率分別為56.41%(22/39)、63.64%(21/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。另在獲取病例進(jìn)行肺癌組織學(xué)分型鑒別診斷時(shí)，TTF-1等抗體陽(yáng)性為肺腺癌，CK5/6等抗體陽(yáng)性為肺鱗癌(圖1)。

2.3 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC胸水細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系E-cadherin的陽(yáng)性率在低分化組為6.67%(1/15)，顯著低于中+高分化組(41.67%，10/24)(P<0.05，表3)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率為13.04%(3/23)，顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(50.00%，8/16)(P<0.05，表3)；N-cadherin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率為69.57%(16/23)，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(31.25%，5/16)(P<0.05，表3)。β-catentin的異常陽(yáng)性率在低分化組為100.00%(15/15)，顯著高于中+高分化組(66.67%，16/24)(P<0.05，表4)；vimentin在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為31.25%(5/16)，顯著低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(73.91%，17/23)(P<0.05，表4)。以上4個(gè)抗體表達(dá)均與患者年齡、性別、吸煙史和組織學(xué)類型無(wú)關(guān)。

表1 E-cadherin、N-cadherin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達(dá)

a.NSCLC細(xì)胞組與NSCLC活檢組相比；b.NSCLC活檢組與NSCLC癌旁組織組相比；c.NSCLC細(xì)胞組與NSCLC癌旁組織組相比

表2 β-catentin及vimentin在NSCLC細(xì)胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達(dá)

a.NSCLC細(xì)胞組與NSCLC活檢組相比；b.NSCLC活檢組與NSCLC癌旁組織組相比；c.NSCLC細(xì)胞組與NSCLC癌旁組織組相比

ABCDEFGH圖1 NSCLC病理學(xué)與EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá):A.NSCLC胸水TCT,巴氏染色;B.NSCLC胸水沉渣包埋組織HE染色;C.E-cadherin在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法;D.N-cadherin在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法;E.β-catentin在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法;F.vimentin在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法;G.TTF-1在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法;H.CK5/6在NSCLC胸水細(xì)胞中陽(yáng)性,SP法

3 討論

目前，肺癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中約85%的確診病例是NSCLC[5]。EMT是細(xì)胞從上皮向間質(zhì)表型發(fā)生、發(fā)育轉(zhuǎn)變的過程，該過程與胚胎形態(tài)發(fā)生有關(guān)，也與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，以其發(fā)生的特定生物學(xué)環(huán)境為依據(jù)將其分為三型[7]：1型，EMT主要通過間充質(zhì)細(xì)胞上皮化過程產(chǎn)生次級(jí)上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)胚胎形成過程中的細(xì)胞類型多樣化；2型，通過產(chǎn)生纖維細(xì)胞以修復(fù)由創(chuàng)傷和炎癥反應(yīng)造成的組織損傷；3型，原發(fā)性上皮組織腫瘤細(xì)胞形成具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞，隨血流轉(zhuǎn)移至不同部位，進(jìn)而形成上皮細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，該型EMT在腫瘤遷移和侵襲過程中是極其重要的一步，也是近年研究的熱點(diǎn)，其在形態(tài)上主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去分化特征，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞骨架重建，細(xì)胞失去極性，黏附力下降，進(jìn)而獲得較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)獲得了間質(zhì)細(xì)胞特征，細(xì)胞形態(tài)由多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮蔚睦w維細(xì)胞樣形態(tài)[8]。這些變化通過相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)改變而顯現(xiàn)出來。

由于NSCLC早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期，此時(shí)患者也多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是發(fā)生在一系列不連續(xù)或相對(duì)獨(dú)立的步驟中，包括侵襲、血管生成、淋巴血管空間滲透和繼發(fā)腫瘤的建立。MPE是腫瘤轉(zhuǎn)移的一種類型，對(duì)NSCLC患者通常是一種預(yù)后不良的征象[9-10]，其潛在機(jī)制比其他類型轉(zhuǎn)移引起的關(guān)注要少，在既往組織學(xué)研究中，與所有其它實(shí)體腫瘤一樣，NSCLC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也可以由EMT過程來闡述[11-12]，臨床上最常用的檢查樣本是來自腫瘤組織的活檢樣本，是通過閉合胸膜活檢或胸腔鏡肺活檢獲得，這些方法均意味著侵入性手術(shù)和潛在的高風(fēng)險(xiǎn)，相較于活檢標(biāo)本，胸腔積液的取樣較容易、創(chuàng)傷性小且可重復(fù)，因此，有必要進(jìn)一步試驗(yàn)確定其能否作為組織替代物應(yīng)用到腫瘤的預(yù)防與治療研究中去[13]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞學(xué)入手，對(duì)比NSCLC細(xì)胞組與NSCLC活檢組各抗體的陽(yáng)性率之間差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示通過沉渣包埋MPE中脫落細(xì)胞EMT各標(biāo)志物的陽(yáng)性結(jié)果表達(dá)同活檢組織學(xué)一樣，即表現(xiàn)為E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)降低或缺失，N-cadherin、vimentin等間葉細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性[14]，同時(shí)黏附蛋白的輔助分子β-catentin的入核，即異常陽(yáng)性率增高(NSCLC細(xì)胞組、NSCLC活檢組各抗體陽(yáng)性率均與NSCLC癌旁組比較)。這些均說明應(yīng)用MPE細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果與活檢組織檢測(cè)結(jié)果一致，既EMT在NSCLC的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用，因此，通過進(jìn)一步的研究和優(yōu)化，使MPE細(xì)胞作為腫瘤活檢組織的有效替代物，進(jìn)而讓我們更好的理解EMT過程中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和惡性生物學(xué)行為，同時(shí)為新的靶向治療藥物的研究提供新思路和新方向，以便進(jìn)行更可靠、有臨床意義的腫瘤診斷和治療，將是NSCLC腫瘤學(xué)研究的新突破口。

表3 E-cadherin、N-cadherin在NSCLC胸水細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

a.腺癌與鱗癌相比；b.鱗癌與腺鱗癌相比；c.腺癌與腺鱗癌相比；d.腺癌與大細(xì)胞癌相比

表4 β-catentin、vimentin在NSCLC胸水細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

a.腺癌與鱗癌相比；b.鱗癌與腺鱗癌相比；c.腺癌與腺鱗癌相比；d.腺癌與大細(xì)胞癌相比