章萍萍，黃 悅，黃文斌，王勁松，呂 倩，趙有財

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常見的惡性甲狀腺腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的70%以上[1]。典型的PTC根據(jù)毛玻璃樣細(xì)胞核、核溝、核內(nèi)包涵體以及砂礫體等特征，常規(guī)HE染色即可診斷，然而，對于濾泡亞型和微小亞型乳頭狀癌，易誤診為濾泡性腫瘤或因體積小而漏診。具有乳頭樣核特征的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤(non-invasive follicular thyroid neoplasms with papillary-like nuclear features, NIFTP)是2017版甲狀腺腫瘤WHO分類中提出的一種交界性腫瘤，因形態(tài)學(xué)類似于乳頭狀癌而被誤診為濾泡亞型乳頭狀癌[2]。近年來一些免疫組化標(biāo)志物如Galectin-3、CK19、HBME-1和CD56可有助于PTC的診斷，但其敏感性和特異性均不理想，因此需要更好的免疫標(biāo)志物來協(xié)助診斷PTC[3-4]。人類滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(Human trophoblast cell-surface marker，TROP-2)又稱腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2(tumor-associated calcium signal transducer-2)，研究發(fā)現(xiàn)TROP-2過表達(dá)與人類腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)[5-8]。TROP-2在PTC中表達(dá)的臨床意義及其診斷價值國外已有一些文獻(xiàn)報道，但結(jié)果不甚一致，而國內(nèi)少有文獻(xiàn)報道。本文采用免疫組化EnVision法檢測TROP-2在各種甲狀腺良惡性病變中的表達(dá)，同時分析TROP-2表達(dá)與PTC臨床病理特征及BRAF V600E基因突變之間的關(guān)系，探討其在PTC表達(dá)的臨床意義以及診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2018年南京市第一醫(yī)院病理科存檔的甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本150例，患者年齡35～76歲，中位年齡47歲，其中男性54例，女性96例。150例中，惡性腫瘤100例(乳頭狀癌75例、濾泡性癌10例、髓樣癌10例、差分化癌5例)，良性病變45例(正常甲狀腺10例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫10例、橋本甲狀腺炎15例、濾泡性腺瘤10例)，NIFTP 5例。所有病例均由兩位副主任醫(yī)師復(fù)習(xí)切片并確診。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)(10%檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液，pH 6.0)；滴加100 μL一抗(羊抗人TROP-2多克隆抗體，購自北京中杉金橋公司)，4 ℃過夜；滴加100 μL經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗；沖洗后DAB顯色；蘇木精復(fù)染后中性樹膠封固。

1.2.2BRAF V600E基因突變檢測 刮取1～5片福爾馬林固定石蠟包埋組織(Formaldehyde fixation paraffin embedded tissue, FFPET)樣品至1.5 mL離心管中，加入1 mL二甲苯震蕩混勻10 s，然后室溫離心去除上清，加入1 mL無水乙醇，離心和去除上清。核酸提取試劑盒和人BRAF V600E基因突變檢測試劑盒均為艾德公司產(chǎn)品，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)在羅氏Cobas Z 480 PCR儀上進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷TROP-2陽性定位于細(xì)胞膜。TROP-2陽性僅評估陽性細(xì)胞占整個組織的百分比，而不評比染色強(qiáng)度。為確定TROP-2表達(dá)對PTC的診斷價值，根據(jù)文獻(xiàn)[9]將TROP-2的陽性設(shè)定為>10%作為診斷PTC的最佳閾值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，TROP-2表達(dá)與PTC臨床病理特征及BRAF V600E突變之間的關(guān)系采用χ2檢驗及Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 TROP-2在甲狀腺良惡性病變中的表達(dá)TROP-2在PTC中的陽性率為81.3%(61/75)，且大多數(shù)病例表現(xiàn)為強(qiáng)烈的膜陽性，而在甲狀腺濾泡性癌、髓樣癌和差分化癌中均陰性(圖1A、B)。在PTC中，TROP-2表達(dá)在微小型PTC、術(shù)中冷凍剩余PTC以及PTC在周圍甲狀腺組織中的擴(kuò)散非常明顯(圖2A～C)。TROP-2在所有良性甲狀腺病變以及5例NIFTP中均陰性(圖3)。TROP-2對PTC診斷的敏感性為81.3%，特異性為100%。

2.2 TROP-2表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系PTC中TROP-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、部位和臨床分期均無關(guān)(P>0.05)。TROP-2表達(dá)亦與PTC的組織學(xué)類型有關(guān)，經(jīng)典型PTC中TROP-2表達(dá)明顯高于濾泡亞型PTC(P<0.05，表1)。

2.3 TROP-2表達(dá)與PTC中BRAF V600E基因突變之間的關(guān)系75例PTC中，BRAF V600E基因突變者63例，BRAF V600E基因突變率為84.0%。61例TROP-2陽性者中，54例BRAF V600E發(fā)生基因突變，14例TROP-2陰性者，BRAF V600E基因突變9例，相關(guān)性分析顯示，TROP-2表達(dá)與PTC BRAF V600E基因突變呈正相關(guān)(P=0.041)。

圖1A.經(jīng)典型PTC中TROP-2陽性，EnVision法；B.濾泡亞型PTC中TROP-2陽性，EnVision法圖2A.微小型PTC中TROP-2陽性，EnVision法；B.術(shù)中冷凍剩余PTC組織中TROP-2陽性，EnVision法；C.PTC周圍甲狀腺組織中擴(kuò)散的乳頭狀癌成分TROP-2陽性，EnVision法圖3NIFTP中TROP-2陰性，EnVision法

表1 TROP-2表達(dá)與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

在甲狀腺腫瘤的診斷中，根據(jù)典型的細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)通常能夠明確診斷，但是在有些病變中如濾泡性腫瘤和PTC濾泡亞型之間，單從組織形態(tài)學(xué)上診斷難度較大。甚至對于有些復(fù)雜病例，病理學(xué)專家也不能給出明確的診斷和鑒別[9-10]。雖然目前已經(jīng)提出的一些免疫標(biāo)志物如CK19、Galectin-3、HBME-1用于甲狀腺腫瘤的診斷和鑒別診斷，但三者均無特異性，因為這些抗體均可以在甲狀腺良性病變中表達(dá)。實際工作中多數(shù)是各種抗體的聯(lián)合應(yīng)用來提高診斷的可靠性[11]。TROP-2是一種最初在人胎盤滋養(yǎng)層組織中鑒定出的I型跨膜糖蛋白[12]。近來研究發(fā)現(xiàn)其在正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)，功能上發(fā)揮著致癌基因的作用，而在腫瘤組織中TROP-2卻有過表達(dá)現(xiàn)象，包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等[5,13-14]。Finley等[15]采用聚類分析和基因測序法對14例PTC和21例甲狀腺良性腫瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PTC相比較甲狀腺良性腫瘤具有明顯的異?；虮磉_(dá)，而TROP-2經(jīng)測序分析被證實在PTC中過表達(dá)。Liu等[16]分析136例甲狀腺腫瘤組織微陣列芯片中TROP-2的表達(dá)，同時對于其中的61例非典型甲狀腺濾泡性病變也進(jìn)行了Galectin-3、CK19及HBME-1的表達(dá)檢測，研究結(jié)果表明，在PTC和良性病變中TROP-2的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Bychkov等[17]分析了226例甲狀腺腫瘤和207例對照組中TROP-2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有乳頭狀微小癌、經(jīng)典型PTC和高細(xì)胞亞型PTC中TROP-2呈彌漫陽性，而濾泡亞型PTC僅52.6%陽性且僅局灶陽性，TROP-2對于PTC診斷的敏感性為98.1%，特異性為97.5%，同時該研究亦發(fā)現(xiàn)TROP-2陽性>10%支持PTC的診斷。然而，Murtezaoglu等[18]研究發(fā)現(xiàn)TROP-2雖然在PTC中的表達(dá)高于良性甲狀腺病變，但TROP-2對PTC診斷的敏感性和特異性低于HBME-1和CK19。導(dǎo)致結(jié)果不一致性的原因主要是由于使用的TROP-2克隆號以及其陽性閾值。甲狀腺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中TROP-2的免疫組化檢測對PTC的診斷也具有潛在的臨床價值[19]。本實驗采用文獻(xiàn)推薦的10%作為陽性閾值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TROP-2在81.3%PTC中陽性，而在所有其他甲狀腺惡性腫瘤以及良性病變中均陰性，提示TROP-2是一種診斷PTC的高度特異性和敏感性的標(biāo)志物，臨床病理工作中可與目前常規(guī)使用的CK19、HBME-1、Galectin-3和CD56聯(lián)合檢測，提高PTC的診斷準(zhǔn)確性。NIFTP是WHO(2017)甲狀腺腫瘤分類中新提出的一種甲狀腺交界性腫瘤，由于具有PTC的核特征而易誤診為PTC，從而導(dǎo)致患者不必要的頸部淋巴結(jié)清掃。本組5例NIFTP中TROP-2均陰性，提示TROP-2可能有助于NIFTP與濾泡亞型PTC的鑒別診斷，由于本組例數(shù)較少，尚需加大樣本量進(jìn)一步進(jìn)行研究。

TROP-2作為一種腫瘤致癌基因，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤如喉癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和膽囊癌等中過表達(dá)，而且TROP-2過表達(dá)是各種惡性腫瘤的不良預(yù)后因子[5]。本組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTC中TROP-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者年齡、性別、臨床分期無關(guān)，本組實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本符合[17,20]。本實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，TROP-2在經(jīng)典型PTC中的表達(dá)高于濾泡亞型PTC，而TROP-2可活化ERK1/2通路，在MAPK依賴性甲狀腺癌發(fā)生中可能具有一定的作用[17]，因而推測TROP-2在不同亞型PTC中表達(dá)不同可能涉及到這些亞型PTC的發(fā)生機(jī)制不同。BRAF V600E基因作為PTC一種最重要的分子遺傳學(xué)事件，研究證明BRAF V600E基因突變的PTC具有較高的侵襲性和較差的預(yù)后[21]。Bychkov等[17]和Kong等[20]研究發(fā)現(xiàn)PTC中TROP-2表達(dá)與BRAF V600E基因突變有關(guān)，本組實驗結(jié)果亦顯示，PTC中TROP-2表達(dá)與BRAF V600E基因突變呈正相關(guān)，這些研究提示TROP-2可能通過直接或間接誘導(dǎo)ERK通路活化，從而影響腫瘤進(jìn)展或臨床結(jié)局，但需要從細(xì)胞學(xué)或分子水平上進(jìn)一步研究。

臨床病理診斷中，甲狀腺冷凍剩余標(biāo)本中的PTC形態(tài)學(xué)變化，微小型PTC有時僅有數(shù)個濾泡改變，PTC的甲狀腺內(nèi)擴(kuò)散均可能在日常工作中發(fā)生誤診、漏診或報告不足，從而影響臨床醫(yī)師的處理。本實驗中觀察到TROP-2在這些情況下呈彌漫強(qiáng)陽性，非常有助于PTC的診斷和擴(kuò)散病灶的識別，提示當(dāng)出現(xiàn)石蠟切片病理診斷與快速診斷不一致、懷疑微小癌或甲狀腺內(nèi)擴(kuò)散時可使用TROP-2免疫組化檢測來提高PTC的檢出率，從而有助于臨床的正確處理。

總之，TROP-2是診斷PTC的一種高度特異性和敏感性的免疫標(biāo)志物，日常工作中與CK19、HBME-1、CD56等聯(lián)合檢測不僅有助于PTC的診斷，而且可預(yù)測PTC患者的臨床生物學(xué)行為和BRAF V600E基因突變狀態(tài)。在組織變形、微小癌及PTC甲狀腺擴(kuò)散的診斷和鑒別診斷中TROP-2也具有較高的應(yīng)用價值。