劉玉東，甄 娟，韓曉麗，郭明麗

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤之一，超過90%的喉癌為普通型喉鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱喉鱗狀細(xì)胞癌)，占人類惡性腫瘤的5%，近年來其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的身體健康。盡管手術(shù)、放化療有了巨大的進(jìn)展，然而患者的長期預(yù)后仍較差，過去的幾十年里其5年生存率僅略微提高，喉鱗狀細(xì)胞癌向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其治療效果差、預(yù)后不良的主要因素，直接影響患者的生存率[1]。因此，識(shí)別與鑒定喉鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物有助于腫瘤生物學(xué)行為的預(yù)測(cè)和患者的預(yù)后判斷，并盡早制定治療策略以延長患者的生存時(shí)間。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(mta)家族，其成員mta2基因編碼轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2(metastasis-associated protein 2, MTA2)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，目前已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[4]、肺癌[5]等組織中作為潛在的促癌基因發(fā)揮生物學(xué)作用，然而其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討MTA2在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義，分析其與喉鱗狀細(xì)胞癌患者5年生存期的關(guān)系，并為評(píng)估喉鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展及患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料河北省人民醫(yī)院2009～2018年耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)切除的120例喉組織標(biāo)本(包括癌旁正常喉組織30例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變30例，喉鱗狀細(xì)胞癌60例)，所有患者均為原發(fā)，術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)HE常規(guī)染色后分別由兩名病理醫(yī)師明確診斷。術(shù)中均留取喉組織，其中喉鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)時(shí)一并留取癌旁組織(距離癌組織>1 cm)，所有組織離體后立即取部分放入液氮后移入-70 ℃冰箱保存，以備Western blot檢測(cè)。

1.2 免疫組化免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑均購自福州邁新公司，MTA2鼠單克隆抗體(sc-55566)購自美國Santa Cruz公司。免疫組化染色采用SP法，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性切片作陽性對(duì)照。MTA2蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性顯色。MTA2蛋白陽性標(biāo)準(zhǔn)采用陽性細(xì)胞百分比和細(xì)胞著色強(qiáng)度判斷。按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分、≤10%為1分、11%～50%為2分，51%～80%為3分、>80%為4分；按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、黃褐色為3分。上述兩者相乘作為最終結(jié)果：<3分為陰性、≥3分為陽性。

1.3 Western blot檢測(cè)在收集的新鮮組織內(nèi)加入裂解液充分裂解，低溫高速離心(4 ℃，15 000 r/min，30 min)，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為120 μg。電泳(12%SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉，一抗MTA2(1 ∶150)和β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像，分析特異性條帶的光密度值，將β-actin光密度值作為內(nèi)參照，對(duì)目的蛋白(MTA2蛋白)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.4 隨訪對(duì)所有喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后進(jìn)行定期隨訪，隨訪以接受手術(shù)始，截至日期為2018年12月31日。隨訪采用門診、電話以及患者復(fù)查，平均每3～6個(gè)月隨訪1次，以患者死亡時(shí)間止，中途失訪者的終止時(shí)間為最后1次隨訪，亦納入生存分析，統(tǒng)計(jì)滿5年隨訪時(shí)間的患者共35例進(jìn)行生存分析。

2 結(jié)果

2.1 MTA2蛋白在喉組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，MTA2蛋白陽性主要定位于細(xì)胞核，正常喉組織(6.67%，2/30)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織(43.33%，13/30)和喉鱗狀細(xì)胞癌組織(73.33%，44/60)中MTA2的陽性率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.11，P<0.001，圖1)。這提示MTA2在喉鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中作為腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮生物學(xué)作用。MTA2表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌組織學(xué)分級(jí)(P=0.030)、臨床分期(P=0.019)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)呈正相關(guān)，提示MTA2可能與腫瘤的進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)(P均>0.05，表1)。

ABC圖1 MTA2在喉組織中的表達(dá),SP法:A.正常喉組織;B.高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變;C.喉鱗狀細(xì)胞癌

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征與MTA2表達(dá)的關(guān)系

*P<0.05

2.2 MTA2在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，MTA2在正常喉組織(0.98±0.07)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織(1.30±0.07)和喉鱗狀細(xì)胞癌組織(1.46±0.11)中的相對(duì)表達(dá)量依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.194，P<0.001，圖2)。

圖2 MTA2在喉組織中的表達(dá)：1.正常喉組織；2.高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織；3.喉鱗狀細(xì)胞癌組織

2.3 生存分析隨訪5年的患者35例(包括5例刪失患者)納入生存分析。MTA2陽性患者存活2例，死亡19例，5年累積生存率9.52%(2/21)，MTA2陰性患者存活9例，死亡5例，5年累積生存率64.29%(9/14)，MTA2陽性者比陰性者生存率明顯降低(χ2=11.689，P=0.001)；MTA2陽性患者平均生存時(shí)間為25個(gè)月，中位生存時(shí)間19個(gè)月，MTA2陰性患者平均生存時(shí)間為50個(gè)月，中位生存時(shí)間為60個(gè)月，MTA2陽性患者平均生存時(shí)間和中位生存時(shí)間顯著低于陰性患者(χ2=10.190，P=0.001，表2，圖3)。對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的單因素分析結(jié)果表明，MTA2表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的生存時(shí)間相關(guān)(P均<0.05，表2)。將單因素分析中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入Cox多變量回歸分析，結(jié)果表明MTA2表達(dá)(HR=2.616)、臨床分期(HR=4.131)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=3.851)均是喉鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，MTA2是喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素之一(表3)。

3 討論

頭頸部腫瘤是全球第5常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超過50萬例，其中有90%源自黏膜鱗狀細(xì)胞，而且是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。其中喉鱗狀細(xì)胞癌是僅次于肺癌的第二常見呼吸道黏膜鱗狀細(xì)胞腫瘤。我國東北地區(qū)是喉鱗狀細(xì)胞癌的高發(fā)區(qū)。過去的10年中我國喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是超過一半的喉鱗狀細(xì)胞癌患者在診斷時(shí)已為晚期(即Ⅲ+Ⅳ期)，已經(jīng)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些患者中只有10%～44%可被治愈；而喉鱗狀細(xì)胞癌的早期階段僅通過局部治療就能治愈85%～95%的患者[6-7]。因此探討與喉鱗狀細(xì)胞癌早期診斷和轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)其治療具有重要意義。

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期的單因素分析

*P<0.05

表3 喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期的多因素分析

*P<0.05

圖3 喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征與患者總生存率的關(guān)系：A.MTA2表達(dá)；B.臨床分期；C.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LN)

MTA2蛋白與MTA1蛋白有65%的同源性，N端高度相似，但C端的不同之處在于MTA2蛋白缺少myb區(qū)和SH3結(jié)合區(qū)。人mta2基因定位于染色體11ql2-13.1，含18個(gè)外顯子，啟動(dòng)子位于350 bp，編碼的MTA2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約7.0×104，由668個(gè)氨基酸組成，含4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：1個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域(1～144 AA)、1個(gè)E1M2結(jié)構(gòu)域(145～256 AA)、1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域(263～315 AA)和1個(gè)非典型的GATA的鋅指結(jié)構(gòu)域(367～394 AA)。MTA2通過這些結(jié)構(gòu)域連接到由組蛋白去乙酰酶(HDAC)、核小體重構(gòu)及脫乙?；?NURD)形成的復(fù)合體從而發(fā)揮生物學(xué)作用[8-9]。研究證實(shí)[10]MTA2在惡性腫瘤和其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)存在差異，在同種腫瘤中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)存在差異。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)MTA2在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常胃組織，并且T3+T4期胃癌組織中MTA2表達(dá)明顯高于T1+T2期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中MTA2的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明MTA2可能影響胃癌細(xì)胞的局部侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)MTA2在鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)增高，過表達(dá)MTA2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；干擾MTA2表達(dá)后，出現(xiàn)相反的結(jié)果，同時(shí)MTA2在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并且與鼻咽癌組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，上述研究結(jié)果提示mta2是一個(gè)潛在的促癌基因。本組Western blot結(jié)果顯示從正常喉組織到高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織到喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的MTA2蛋白表達(dá)量逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組化結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)MTA2蛋白的陽性率在喉鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Western blot結(jié)果一致；可由此推測(cè)MTA2在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著促進(jìn)作用。同時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MTA2表達(dá)隨著臨床分期和病理學(xué)分級(jí)的增高而增加，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示MTA2可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)MTA2蛋白與結(jié)腸癌組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，通過生存分析發(fā)現(xiàn)MTA2高表達(dá)結(jié)腸癌患者的生存率明顯低于MTA2低表達(dá)者。甄娟等[14]在卵巢癌中的研究發(fā)現(xiàn)，與MTA2低表達(dá)患者比較，MTA2高表達(dá)患者的存活時(shí)間明顯縮短，多因素回歸分析提示MTA2蛋白為卵巢癌有效的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，MTA2有可能成為判斷惡性腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后的新分子學(xué)標(biāo)志物。那么，在喉鱗狀細(xì)胞癌中MTA2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后存在怎樣的關(guān)系呢？本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析，MTA2蛋白陽性患者比陰性患者的5年生存率及生存時(shí)間明顯縮短，兩組患者生存曲線的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)報(bào)道人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是喉乳頭狀瘤的病原體，HPV 16/18可能在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中起一定作用，也有部分觀點(diǎn)認(rèn)為HPV在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用被夸大[15]，因此本實(shí)驗(yàn)將常見的臨床病理特征列入單因素及多因素分析，結(jié)果提示MTA2蛋白表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的5年生存率和生存時(shí)間有關(guān)，MTA2表達(dá)缺失、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、臨床分期越早，患者的生存時(shí)間越長；多因素分析結(jié)果提示，MTA2蛋白表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為喉鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素，表明MTA2是喉鱗狀細(xì)胞癌患者有效的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，這與上文提及的MTA2可作為判斷結(jié)腸癌、胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素一致，推測(cè)MTA2對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌也具有一定的預(yù)后評(píng)價(jià)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTA2可能在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用；MTA2具有成為喉鱗狀細(xì)胞癌診斷和治療靶點(diǎn)的潛能，可以作為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，然而本實(shí)驗(yàn)只是初步的驗(yàn)證，MTA2參與喉鱗狀細(xì)胞癌的的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。HPV在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的作用也有待我們進(jìn)一步證實(shí)。