鄭 蘭，王馨悅，韓安娜，尹香琳，王藝璇，林貞花，楊 洋

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤總發(fā)病率的40%～50%，且具有發(fā)病隱匿、惡性度高等特點(diǎn)，多數(shù)患者就診時已為疾病晚期。因此，亟待尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷及預(yù)后評估的有效分子靶標(biāo)，以改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。NQO1基因定位于16p22，長度為20 kb，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子。它主要通過雙電子還原反應(yīng)使醌類化合物變成低毒性的氫醌類物質(zhì)，從而使細(xì)胞免受氧化損傷[1-2]。研究顯示，NQO1蛋白高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如甲狀腺[3]、卵巢癌[4]和結(jié)腸癌[5]等。其中，Yang等[6]研究顯示，NQO1蛋白高表達(dá)可作為乳腺癌評估的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。目前，關(guān)于NQO1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本文旨在應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，探討NQO1表達(dá)水平在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床病理學(xué)意義及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織芯片購于上海芯超生物公司，包含122例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，17例癌旁正常組織。所有患者臨床、病理及實(shí)驗(yàn)室資料完整。病理類型和惡性程度按WHO(2018)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。

1.2 試劑NQO1鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司(sc-32793)；免疫組化EnVision法檢測試劑盒購自DAKO產(chǎn)品。

1.3 方法免疫組化采用EnVision法染色。組織芯片行常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化，于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中熱修復(fù)，經(jīng)PBS緩沖液清洗，加入l ∶200稀釋的鼠抗NQO1抗體4 ℃冰箱孵育過夜，標(biāo)記辣根過氧化物酶的抗鼠二抗室溫下孵育45 min，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。為了證明NQO1蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用鼠IgG代替一抗作為對照，結(jié)果為陰性。同時，選擇NQO1蛋白陽性染色切片，以PBS代替一抗染色結(jié)果為陰性。利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中NQO1 mRNA的表達(dá)，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)NQO1蛋白表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色顆粒為陽性。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()。其中≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。以“-”為陰性，“+”為陽性，“～”為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法，運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析。以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核。在122例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，NQO1蛋白的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為88.5%(108/122)和52.5%(64/122)。在17例癌旁正常組織中，NQO1蛋白的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為29.4%(5/17)和5.9%(1/17)。NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且差異有顯著性(P<0.01，表1，圖1)。

圖1A. NQO1蛋白在癌旁正常組織中呈陰性(-)，EnVision法；B. NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈弱陽性(+)，EnVision法；C.NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈強(qiáng)陽性，EnVision法()；D. NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈強(qiáng)陽性()，EnVision法

表1 癌旁正常組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中NQO1蛋白的表達(dá)

與癌旁正常組織相比，**P<0.01

2.2 NQO1蛋白高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析NQO1蛋白高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：NQO1蛋白高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)生部位及浸潤情況無關(guān)，與臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)。其中，NQO1蛋白在晚期(Ⅲ+Ⅳ)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的強(qiáng)陽性率(46/75，61.3%)明顯高于早期(Ⅰ+Ⅱ)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織(18/47，38.3%)(P=0.013，表2)；提示NQO1蛋白可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理特征與NQO1高表達(dá)的關(guān)系[n(%)]

組間比較，*P<0.05

2.3 NQO1蛋白高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，在162例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中，NQO1 mRNA高表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的無瘤生存期明顯低于NQO1 mRNA低表達(dá)者(P<0.05，圖2)，但總生存期差異無顯著性。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn) NQO1 基因609位點(diǎn)可發(fā)生 C-T的突變，導(dǎo)致原來野生純合CC基因型變成突變雜合CT或突變純合TT基因型，致使該酶活性減弱或完全喪失，降低NQO1解毒及維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)定的功能，因而增加某些易感個體細(xì)胞發(fā)生癌變的可能性，使其具有促癌作用[7]。本組發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，NQO1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的陽性率明顯升高，與NQO1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)的報(bào)道一致[8-12]。NQO1蛋白高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的病理分級密切相關(guān)，但與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及有無浸潤無相關(guān)性。以上結(jié)果均提示，NQO1蛋白高表達(dá)可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。Li等[13]認(rèn)為NQO1是值得有效利用的腫瘤特異性標(biāo)志物，其不受細(xì)胞周期及抑癌基因的影響和控制。因此，推測NQO1的持續(xù)異常激活可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析NQO1高表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后：A.NQO1 mRNA表達(dá)水平與總生存期無關(guān)；B. NQO1 mRNA高表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的無瘤生存期低于NQO1 mRNA低表達(dá)患者(P=0.044)

我們前期研究表明，NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌中呈高表達(dá)，是卵巢黏液性囊腺癌的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[14]；NQO1蛋白對結(jié)直腸癌患者生存期有顯著影響，可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估的分子標(biāo)志物[5]。此外，在乳腺癌中NQO1蛋白高表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[15]，且NQO1/PKLR軸激活可通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝重編程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤演進(jìn)[8]，抑制NQO1表達(dá)可調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖及EMT過程[15]。本實(shí)驗(yàn)通過TCGA數(shù)據(jù)庫生存分析發(fā)現(xiàn)，NQO1 mRNA高表達(dá)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的無瘤生存期顯著低于NQO1 mRNA低表達(dá)者，提示NQO1高表達(dá)可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤判斷預(yù)后的有效標(biāo)志物。

綜上所述，NQO1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的演進(jìn)過程中起重要作用，對于判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展及預(yù)后具有重要的指示意義。NQO1蛋白有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷、治療和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，NQO1在惡性腫瘤中高表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析證實(shí)。