任志恒，張晨麗，張 曉，史淑霞，徐金宇，張 煦，胡 燕，王斌生

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤[1-2]，治療以手術(shù)和放、化療為主，但對已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者療效不佳[3]。因此，尋找新的胃癌靶向藥物成為亟待解決的問題。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)屬于小分子甘油磷脂，可調(diào)控肝細(xì)胞癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的侵襲遷移[4-5]。LPA受體分為6個亞型：LPA1～6[6]，其中LPA2研究較為廣泛，與多種惡性腫瘤的病理學(xué)分期、分級及患者的不良預(yù)后相關(guān)[7-9]。Notch信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，該通路由Nocth1～4受體組成，與其配體結(jié)合后經(jīng)γ-分泌酶酶切，釋放其胞外域及胞內(nèi)域ICN，并與CSL蛋白結(jié)合使之活化，進(jìn)一步激活下游靶基因(如Hes-1)的轉(zhuǎn)錄[10]。γ-分泌酶抑制劑可阻斷Notch通路的活化，文獻(xiàn)報道[11-12]γ-分泌酶抑制劑聯(lián)合其他天然化合物，對治療HER-2陽性乳腺癌患者具有良好的前景。本文著重探討γ-分泌酶抑制劑是否能阻斷LPA誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲遷移，為胃癌臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由本實驗室長期保存。細(xì)胞培養(yǎng)于含1%的青霉素/鏈霉素混合液(Sigma)和10%的胎牛血清(BI)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclon)中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天使用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)(Hyclon)消化并傳代。

1.2 主要試劑及材料MTS試劑盒(Promega)，Transwell小室(Corning)，Matrigel膠(BD)，一抗稀釋液、DAPI、FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Solarbio)，人源LPA2(EDG4)抗體(Abcam)，Notch1、Hes-1、E-cadherin、vimentin抗體(CST)，β-actin抗體(Thermo)，二抗(Santa Cruz)，LPA(Sigma)，MK-0752(Selleck)。

1.3 Western blot 檢測取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%～80%融合度時，實驗組細(xì)胞使用5 μmol/L MK-0752預(yù)處理24 h，然后在刺激組細(xì)胞中加入15 μmol/L LPA刺激細(xì)胞24 h，處理樣品，加入1×SDS蛋白上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，以LPA2(1 ∶1 000)、Notch1(1 ∶1 000)、Hes-1(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、F-actin(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)孵育2 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光工作液曝光、拍照。

1.4 Transwell侵襲遷移實驗

1.4.1Transwell遷移實驗 實驗組細(xì)胞使用MK-0752預(yù)處理24 h后，將孔徑為0.8 μm的Transwell小室置入24孔板中，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌并用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整每孔為2×105個細(xì)胞，然后在小室上腔加入200 μL的細(xì)胞懸液，小室下腔加入700 μL的含15 μmol/L LPA或完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。

1.4.2Transwell侵襲實驗 實驗組細(xì)胞使用MK-0752預(yù)處理24 h后，稀釋Matrigel基質(zhì)膠(Matrigel基質(zhì)膠 ∶預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基=1 ∶8)，并充分混勻。在Transwell小室上腔中加入100 μL以覆蓋整個碳酸酯膜。后續(xù)操作同遷移實驗。

1.5 細(xì)胞活力檢測使用MTS測定5 μmol/L MK-0752、15 μmol/L LPA是否對細(xì)胞活力造成影響。實驗前將MTS Cell Titer96 AQueous One Solution Reagent 37 ℃水浴10 min，直接加入96孔板，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育2.5 h，然后酶標(biāo)儀讀取490 nm處的吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果，用以下公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.6 間接免疫熒光共聚焦檢測實驗組細(xì)胞預(yù)先用5 μmol/L MK-0752預(yù)處理，待其生長至70%～80%融合度后，以每孔2×104個細(xì)胞接種于Nunc玻璃小皿中，加入15 μmol/L LPA或完全培養(yǎng)基，24 h后收樣，PBS洗滌細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定，使用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞骨架，4 ℃避光過夜；使用DAPI染細(xì)胞核，最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察，并拍照保存圖片。

2 結(jié)果

2.1 MK-0752對LPA誘導(dǎo)LPA2、Notch1、Hes-1表達(dá)的影響實驗組細(xì)胞預(yù)先使用5 μmol/L MK-0752處理24 h；在刺激組中加入15 μmol/L LPA培養(yǎng) 24 h，Western blot結(jié)果顯示：在使用MK-0752預(yù)處理的細(xì)胞中，LPA2、Notch1、Hes-1的表達(dá)比空白對照組低，且預(yù)處理組在使用LPA刺激后目的分子表達(dá)比空白刺激組低。MTS實驗檢測在5 μmol/L MK-0752和15 μmol/L LPA作用下的細(xì)胞活力，結(jié)果表明：所用藥物濃度并未對細(xì)胞活力造成影響，因此選擇該濃度為后續(xù)實驗中的藥物濃度(圖1)。

圖1 A.Western blot檢測四組細(xì)胞中LPA2、Notch1、Hes-1的表達(dá)；B.MTS檢測MK-0752濃度對細(xì)胞活力的影響；C.MTS檢測LPA濃度對細(xì)胞活力的影響

2.2 MK-0752對LPA誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞侵襲遷移的影響Transwell侵襲遷移實驗表明：使用MK-0752預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)比空白對照組低(P<0.01)；在下室加入15 μmol/L的LPA后，空白刺激組的穿膜細(xì)胞數(shù)比實驗組增多(P<0.01)。實驗結(jié)果顯示：MK-0752可抑制由LPA誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲遷移(圖2)。

圖2 A.Transwell遷移實驗檢測四組細(xì)胞的遷移能力；B.Transwell侵襲實驗檢測四組細(xì)胞的侵襲能力；P均<0.01，LPA(-)：空白對照組；LPA(+)：空白刺激組；MK-0752(-)：實驗組；MK-0752(+)：實驗刺激組

2.3 MK-0752對LPA誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞EMT的影響采用Western blot檢測MK-0752預(yù)處理細(xì)胞后，使用LPA刺激細(xì)胞中E-cadherin、vimentin的表達(dá)。實驗組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)比處理后刺激組明顯增多；vimentin的表達(dá)趨勢則與之相反。以上結(jié)果提示：MK-0752是通過抑制由LPA誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞發(fā)生EMT過程，進(jìn)而抑制細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移(圖3)。

圖3 Western blot檢測四組細(xì)胞中E-cadherin、vimentin的表達(dá)

2.4 MK-0752對LPA誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響采用間接免疫熒光共聚焦觀察四組細(xì)胞的細(xì)胞骨架：空白刺激組的細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)由橢圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞表面絲狀物增多(細(xì)胞骨架蛋白增多)，細(xì)胞周圍凸起增多(偽足形成)；實驗組細(xì)胞中加入LPA后，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。結(jié)果顯示：MK-0752可抑制由LPA引起的SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，阻止細(xì)胞形成偽足，進(jìn)而抑制細(xì)胞運動(圖4)。

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤，因缺乏早期診斷及侵襲遷移能力較強(qiáng)，其預(yù)后較差[13]。因此，尋求胃癌治療的新思路一直備受專家、學(xué)者們的關(guān)注。

LPA和LPA2結(jié)合后可在人體的正常生理及病理中發(fā)揮不同作用，正常時兩者結(jié)合后，通過G蛋白偶聯(lián)信號通路可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、加速傷口愈合[14]；異常時兩者結(jié)合可加速乳腺癌、肝癌、卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移，且在卵巢惡性上皮性腫瘤中，LPA2的高表達(dá)與患者組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹水形成量呈正相關(guān)；LPA可刺激胃癌細(xì)胞增殖并使其惡性程度增高。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LPA2可促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901的抗凋亡、促侵襲和遷移能力[15]，且在SGC-7901細(xì)胞中有兩種跨膜蛋白LPA2和Notch1的協(xié)同作用，在LPA的刺激下該作用被放大，以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞惡性程度[16]。

圖4A.間接免疫熒光共聚焦觀察空白組、實驗組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；B.間接免疫熒光共聚焦觀察空白刺激組、實驗刺激組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Notch1作為Notch通路中的關(guān)鍵分子，與非小細(xì)胞肺癌、直腸癌患者的病理學(xué)分期及預(yù)后密切相關(guān)[17-18]。Notch1高表達(dá)可增強(qiáng)腎透明細(xì)胞癌、結(jié)腸細(xì)胞的侵襲遷移能力[19-20]。本實驗使用Notch通路阻斷劑—— γ-分泌酶抑制劑，首次發(fā)現(xiàn)MK-0752可抑制由LPA誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901中LPA2和Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)。

腫瘤從原位癌發(fā)展呈浸潤癌需要EMT過程，這是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移的前提。在此過程中，癌細(xì)胞失去上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，使細(xì)胞連接松散易于運動，而間葉標(biāo)志物vimentin表達(dá)增加，有利于細(xì)胞維持形態(tài)及運動[21]。本實驗結(jié)果表明：在LPA刺激下胃癌細(xì)胞SGC-7901中E-cadherin表達(dá)降低，vimentin表達(dá)增加；該作用可在使用MK-0752處理的細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)，提示γ-分泌酶抑制劑可阻斷由LPA誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞EMT過程。

EMT過程中伴細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞由原來的規(guī)則形態(tài)變?yōu)槔谄溥\動遷移的不規(guī)則形態(tài)，在此過程中細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生重構(gòu)，細(xì)胞偽足形成[22-23]。本組發(fā)現(xiàn)，在LPA刺激下SGC-7901細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，但在MK-0752處理的細(xì)胞中未見明顯改變；提示γ-分泌酶抑制劑可以抑制由LPA誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

近年γ-分泌酶抑制劑在惡性腫瘤治療的研究中較為廣泛，可通過阻斷Notch通路抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖并促進(jìn)其凋亡；盧余莉等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的藥物治療中γ-分泌酶抑制劑與其他傳統(tǒng)化療藥物有明顯不同。本組結(jié)果提示γ-分泌酶抑制可抑制由致瘤因子LPA引起的胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，將Notch信號通路與LPA、LPA2軸聯(lián)系在一起。

綜上所述，本實驗僅從體外細(xì)胞學(xué)實驗中初步探討γ-分泌酶抑制劑對胃癌細(xì)胞的抑制作用，可作為分析胃癌新治療方法的實驗與理論提供基礎(chǔ)；其具體作用機(jī)制還需進(jìn)行動物學(xué)實驗及相關(guān)分子生物學(xué)實驗分析，以期為胃癌耐藥患者提供更好的藥物治療方案。