任 崗 宣鑫玲 謝亞婷 李碧瑩 陳 旻 蔡亞軍 沈文英

(1. 紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 紹興 312000; 2. 紹興市水政漁業(yè)執(zhí)法局, 紹興 312000)

中國東部除長江、淮河、閩江等大型河流外多為流域面積小、水位落差大、干流長度短、地表徑流大的中小型河流, 如曹娥江、甬江、九龍江等。由于處于經(jīng)濟社會發(fā)達地區(qū), 水利設(shè)施阻隔、水體污染、過度捕撈等因素對河流水生生物特別是魚類的生境造成了較大的破壞, 生態(tài)系統(tǒng)較為脆弱[1,2]。物種遺傳多樣性是指物種內(nèi)不同群體或同一群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和, 它是生物多樣性的重要組成部分。遺傳多樣性水平不僅反映了一個物種的進化歷史和潛力, 同時也體現(xiàn)了物種對不良生存環(huán)境條件的適應(yīng)和抵抗能力[3]。開展研究魚類遺傳多樣性不僅有助于了解魚類物種的起源、適應(yīng)進化歷程的遺傳基礎(chǔ), 同時也為合理保護和開發(fā)利用魚類資源提供科學(xué)依據(jù)[4]。然而, 目前已有的研究對中國東部中小型河流整個水系魚類的遺傳多樣性水平缺乏整體的了解和評估; 同時對于水利工程建設(shè)、水體污染、過度捕撈等人為干擾因素對魚類遺傳多樣性影響的研究仍多以單一魚類種類為研究對象, 其影響程度缺乏全面科學(xué)的評估。

曹娥江是紹興市的母親河, 其自然地理、生物區(qū)系組成、遭受的外界環(huán)境脅迫等方面在東部中小河流中具有較好的代表性。本研究以曹娥江為例, 分析了來源于不同支流、江段21個種26個群體的代表性魚類基于線粒體細胞色素b基因(Cytb)分子標(biāo)記的遺傳多樣性水平, 并對河流魚類整體的遺傳多樣性水平進行評估。同時, 本研究進一步探討水利工程、過度捕撈和水體污染等人為干擾因素對曹娥江魚類種群遺傳多樣性水平的影響, 以期更加全面客觀的掌握造成目前曹娥江魚類遺傳多樣性現(xiàn)狀的可能原因, 為曹娥江乃至中國東部沿海河流的魚類資源管理、保護和利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2018年5—9月選取曹娥江支流的鏡嶺、黃澤江段, 中下游仙巖、三界、上浦江段和河口的濱海共6個地點作為標(biāo)本采集地(圖1), 在當(dāng)?shù)貪O民協(xié)助下利用流刺網(wǎng)和地籠進行魚類樣品采集。采集的全部魚類樣品活體或冷藏保存帶回實驗室進行分類鑒定。

1.2 魚類種類鑒定及樣品保存

魚類樣品的物種鑒定參考《浙江動物志： 淡水魚類》、《中國魚類系統(tǒng)檢索》進行[5,6], 其食性類型和對環(huán)境的耐受性類型依據(jù)參考文獻[6, 7]確定。每條魚樣品取背部肌肉用無水乙醇-20℃冷凍保存。每個物種及其不同地理群體盡可能取30—40尾個體。

1.3 組織及DNA提取

剪取80 mg魚背部肌肉樣品采用傳統(tǒng)酚—氯仿法提取基因組DNA。

1.4 PCR擴增及測序

以線粒體細胞色素b基因(Cytb)作為分子標(biāo)記,鯉科魚類Cytb基因的PCR擴增采用通用引物L(fēng)14724 和H15915[8], 鱸形目魚類采用引物AFbL和AFbR[9]。對花?(Hemibarbus maculatus)等14種上述引物PCR擴增和測序失敗或效果不佳的魚類根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中該物種線粒體全基因組序列用Primer Premier 6.0軟件[10]設(shè)計引物(表1)。PCR反應(yīng)體系和擴增程序參考何舜平等[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送ThermoFisher公司純化并雙向測序, 測序引物為擴增引物。

圖1 曹娥江流域魚類采樣點(?代表采樣點位置)Fig. 1 Sampling sites of fishes in Cao’s River (? represents sampling sites)

1.5 序列分析

測序獲得的Cytb正反向序列用ContigExpress軟件(版本號Vector NTI Suite 6.0, Invitrogen)進行拼接, 同一物種的序列用Clustal X 2.0軟件[12]進行序列比對和校對, 并用Mega 7.0軟件[13]計算序列的堿基組成。用DNASP4.10軟件[14]計算多態(tài)性位點(S)、單倍型數(shù)(N)、單倍型多樣性指數(shù)(h)和核苷酸多樣性指數(shù)(π)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

曹娥江不同采集江段間、不同環(huán)境耐受性類型間的魚類種群體單倍型多樣性指數(shù)(h)和核苷酸多樣性指數(shù)(π) 結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示, 結(jié)果均用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析進行組間差異分析, 對總體方差差異顯著的再用Duncan法進行多重比較, 顯著差異水平為P＜0.05。不同食性類型間、曹娥江與中國大型河流間魚類種群單倍型多樣性指數(shù)(h)和核苷酸多樣性指數(shù)(π)均用SPSS 20.0軟件的t檢驗進行組間差異分析, 顯著差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚類物種分布

經(jīng)鑒定共捕獲魚類6目17科57屬87種。依據(jù)魚類的分類地位、食性、生活習(xí)性和對環(huán)境的敏感性等特點及不同采樣地點, 選取刀鱭(Coilia nasus)等代表性魚類21個種26個群體, 分屬5目9科屬(表2)。

2.2 Cyt b基因序列變異特征

通過測序、拼接共獲得21個物種26個群體全長1140 bp的Cytb序列638條。Mega 7.0軟件分析序列堿基組成表明, 所有種類Cytb序列均表現(xiàn)出顯著的G堿基偏倚性, A+T含量(平均55%)高于C+G含量(平均45%), 符合魚類線粒體Cytb基因的共有特征[15]。

2.3 曹娥江魚類整體遺傳多樣性水平

單倍型多樣性指數(shù)(h)和核苷酸多樣性指數(shù)(π)是評價物種遺傳多樣性的2個重要指標(biāo), 其數(shù)值越大表明該種群的遺傳多樣性越豐富, 對環(huán)境改變的適應(yīng)能力越強, 其生存競爭力就越強[16]。對21種魚的Cytb基因全長序列的單倍型和核苷酸變異數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn), 多態(tài)性位點數(shù)(S)為1—59, 單倍型數(shù)(N)為2—21, 單倍型多樣性指數(shù)(h)為0.074—0.987,核苷酸多樣性指數(shù)(π)為0.00016—0.01347(表2)。曹娥江魚類種群的遺傳多樣性呈現(xiàn)單倍型多樣性指數(shù)(h)較高而核苷酸多樣性指數(shù)(π)較低的特征。這與我國東部河流淡水魚類的種群相對數(shù)量大、分布廣, 并且總體遺傳多樣性相對豐富的特征相一致[17]。

比較不同江段魚類的遺傳多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn), 從河口、中下游到上游魚類群體單倍型多樣性指數(shù)h顯著降低(表3,P＜0.05), 而核苷酸多樣性指數(shù)π呈逐步增加的趨勢。這一結(jié)果表明, 曹娥江水系魚類的有效種群數(shù)量從河口到上游逐步降低, 種群變得更不穩(wěn)定和脆弱[18]。因此, 在曹娥江魚類資源的管理和保護工作中, 我們需要通過設(shè)立自然保護區(qū)、全面禁捕等更多措施來加強上游地區(qū)魚類資源的保護, 增加魚類種群的數(shù)量。

基于多個物種的魚類遺傳多樣性分析能夠更好的反應(yīng)河流魚類整體的資源狀況。然而, 目前對中國東部中小型河流魚類整體遺傳多樣性還缺乏相關(guān)的研究和評估。本研究選取翹嘴鲌(Culter alburnus)、紅鰭原鲌(Chanodichthys erythropterus)、大眼華鳊(Sinibrama macrops)、細鱗斜頜鲴(Plagiognathops microlepis)、銀(Squalidus argentatus)等9種曹娥江魚類, 將其遺傳多樣性指數(shù)與長江中下游、淮河、珠江等大型河流同一種類的遺傳多樣性指數(shù)進行比較(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 曹娥江魚類種群的核苷酸多樣性指數(shù)水平顯著低于大型河流魚類種群(P＜0.05, 表3), 表明與大型河流中的魚類相比, 曹娥江整體的魚類遺傳多樣性水平處于中等偏下水平, 其可能受到更大的生存脅迫壓力,正在通過更快的核苷酸序列變異來適應(yīng)不利的生境[19]。

表1 本研究中魚類線粒體細胞色素b基因的PCR擴增引物和PCR產(chǎn)物測序引物信息Tab. 1 The primers used for PCR and sequencing

2.4 人為干擾因素對曹娥江魚類遺傳多樣性的影響

曹娥江等東部中小型河流處于經(jīng)濟社會發(fā)達地區(qū), 其生態(tài)系統(tǒng)正遭受水利設(shè)施阻隔、水質(zhì)污染、過度捕撈、棲息地破壞等人為干擾因素的巨大壓力。這些人為干擾因素都可能會對曹娥江魚類的遺傳多樣性產(chǎn)生重要的影響。

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為了探究水利工程曹娥江大閘對魚類遺傳多樣性的影響, 本文選取洄游型魚類刀鱭為研究對象進行河口和內(nèi)河兩個地理群體遺傳多樣性差異分析。結(jié)果表明, 刀鱭內(nèi)河上浦、三界種群單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)水平(h=0.900,π=0.00321)略低于河口濱海種群(h=0.963,π=0.00350)。研究表明, 大型水利工程能夠阻斷魚類等水生生物的洄游, 阻礙魚類種群間的基因交流, 從而降低魚類種群的遺傳多樣性水平[28—30]。本研究結(jié)果表明,盡管曹娥江大閘阻礙了刀鱭的洄游, 限制了內(nèi)河群體數(shù)量的補充, 但由于大閘建設(shè)時間不長, 同時存在過魚設(shè)施, 因此曹娥江內(nèi)河刀鱭的種群遺傳多樣性水平得到了一定程度的維持。此外, 除了曹娥江大閘, 曹娥江干流和支流先后修建了多個攔水大壩、水庫等水利設(shè)施。水利設(shè)施的建設(shè)使得河流水體的流速變緩、浮游生物增加, 促使部分植食性和雜食性魚類數(shù)量增加, 而肉食性魚類數(shù)量減少,進而影響魚類的遺傳多樣性水平和結(jié)構(gòu)[31]。比較曹娥江內(nèi)河9種雜食性和9種肉食性魚類之間的Cytb基因遺傳多樣性水平發(fā)現(xiàn), 兩者的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均無顯著差異(表3)。這一結(jié)果可能與同種食性的魚類中不同物種對由水利設(shè)施引起的生境脅迫壓力產(chǎn)生的遺傳變異速度不同有關(guān)[32]。

水質(zhì)條件是魚類生存的關(guān)鍵因素。為掌握水質(zhì)污染對曹娥江魚類遺傳多樣性的影響, 本研究對來源于中游三界、上浦和仙巖江段不同環(huán)境耐受型魚類的種群遺傳多樣性進行了分析。結(jié)果表明,花?等敏感型魚類種群的單倍型多樣性指數(shù)水平顯著低于刺鰍等中等耐受型魚類(表4,P＜0.05)。從20世紀(jì)90年代后的近二十年間, 曹娥江中下游水域長期受醫(yī)藥化工、造紙等行業(yè)的重金屬和持久性有機物等污染物污染, 致使水體環(huán)境持續(xù)惡化, 對魚類生存造成了巨大的壓力[33]。本研究結(jié)果提示, 曹娥江魚類特別是敏感型魚類遺傳多樣性的下降可能與水質(zhì)污染引起的種群數(shù)量快速減少密切相關(guān)。因此, 開展水域水污染治理將對曹娥江魚類種群數(shù)量的維持和遺傳多樣性的修復(fù)具有重要作用。

表3 基于Cyt b基因序列的曹娥江魚類不同江段間、曹娥江與中國東部大型河流間魚類遺傳多樣性差異比較Tab. 3 The genetic diversities based on Cyt b gene among the fishes from different sections of Cao’e River, and between the fishes from Cao’e River and from the large rivers in East China

表4 基于Cyt b基因序列不同食性類型、環(huán)境耐受性類型的曹娥江魚類遺傳多樣性差異比較Tab. 4 The difference of genetic diversity based on Cyt b gene in fishes from Cao’e River with different types of food habit, environmental tolerance

我們在采樣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)曹娥江上游鏡嶺江段存在不少電捕魚的違法行為, 可能導(dǎo)致該江段魚類資源被過度捕撈。為比較過度捕撈對曹娥江魚類遺傳多樣性水平的影響, 本研究比較了麥穗魚、光澤黃顙魚和刺鰍3種魚類在上游的鏡嶺和中游的仙巖兩個地點種群間的遺傳多樣性差異。結(jié)果表明, 這3種魚的鏡嶺群體的線粒體Cytb基因單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均低于仙巖群體(表3)。研究表明, 過度捕撈可能導(dǎo)致了水域魚類資源的急劇減少, 促使種群內(nèi)近交繁殖, 加速群體遺傳漂變, 從而使流域內(nèi)魚類遺傳多樣性普遍降低[34]。因此, 上述結(jié)果提示, 過度捕撈可能是導(dǎo)致目前曹娥江上游魚類種群遺傳多樣性水平較低的重要原因。

3 結(jié)論

本研究以中國東部沿海地區(qū)中小型河流代表曹娥江為例, 基于線粒體細胞色素b基因(Cytb)分子標(biāo)記對其魚類的整體遺傳多樣性進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明, 與長江等大型河流相比, 曹娥江魚類的整體遺傳多樣性處于中等偏下水平, 其生物多樣性相對較為脆弱。進一步分析人為擾動因素對曹娥江魚類遺傳多樣性水平的影響發(fā)現(xiàn), 水體污染、過度捕撈可能是造成目前曹娥江魚類遺傳多樣性水平較低的主要原因, 魚類資源亟需通過水污染控制、全面禁漁和棲息地生態(tài)修復(fù)等有效措施進行保護。本研究結(jié)果將為曹娥江乃至東部中小河流的魚類資源的管理、保護和開發(fā)利用提供了重要的理論依據(jù)。