曹海鵬 張書萌 虞晶晶 安 健

(1. 上海海洋大學(xué),國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù), 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心, 上海 201306; 4. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 5. 連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心, 連云港 222000)

敵百蟲, 又名馬佐藤, 屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的有機(jī)磷驅(qū)殺蟲劑, 主要通過抑制寄生蟲乙酰膽堿酯酶而使乙酰膽堿在突觸處積累, 引起寄生蟲的神經(jīng)功能紊亂而死亡[1]。近年來, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和魚類寄生蟲病防控需求的增強(qiáng), 敵百蟲的用藥量逐漸增加, 被廣泛用于體外寄生吸蟲、腸內(nèi)寄生蠕蟲以及甲殼動(dòng)物引起的魚類寄生蟲病的防治[2]。然而,據(jù)研究報(bào)道[3—5], 養(yǎng)殖水體中的敵百蟲會(huì)通過呼吸、攝食進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用, 輕者會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物的免疫因子活性, 重者會(huì)直接導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物急性中毒。因此, 敵百蟲的長(zhǎng)期大量使用對(duì)環(huán)境造成的污染不容忽視[6], 養(yǎng)殖水體中敵百蟲的解毒研究對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖健康生產(chǎn)和水體環(huán)境保護(hù)具有重要的意義。目前, 敵百蟲的生物降解法以

其環(huán)保、高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)深受研究者的青睞[7,8]。許多研究表明[6,8,9], 假單胞菌(Pseudomonassp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)、利氏鏈霉菌(Streptomyces levis)、鞘氨醇桿菌(Sphingobiumsp.)、特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)等微生物對(duì)敵百蟲均展現(xiàn)出了良好的降解效果, 對(duì)環(huán)境中敵百蟲的解毒和污染治理具有潛在的應(yīng)用價(jià)值, 但有關(guān)類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)對(duì)敵百蟲的解毒研究卻鮮有報(bào)道。鑒此, 本實(shí)驗(yàn)從養(yǎng)殖污泥中分離篩選了一株敵百蟲耐受菌(XR12), 綜合生理生化特性和16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定,并分析了其藥敏特性、安全性以及對(duì)敵百蟲的解毒效果, 旨在豐富敵百蟲污染治理的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

養(yǎng)殖污泥, 采集于上海青浦某養(yǎng)殖場(chǎng); 斑馬魚(Danio rerio), 平均體重0.15 g, 健康無病傷, 購(gòu)于上海汐靈生物科技有限公司; 標(biāo)準(zhǔn)稀釋水, 根據(jù)《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》(GB/T 13267—1991)[10]配制; 晶體敵百蟲, 有效成分含量為90%, 購(gòu)于湖北沙隆達(dá)股份有限公司; 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯, 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司; 以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌20min, 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 敵百蟲耐受菌株的分離、純化及篩選

參照杜迅等[11]的方法, 將5 g養(yǎng)殖污泥加入到100 mL含敵百蟲濃度為1000 mg/L的無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中混勻, 于25℃搖床培養(yǎng)18h后再于含敵百蟲濃度為1000 mg/L的無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離與純化, 25℃恒溫培養(yǎng)24—48h后, 挑取單菌落進(jìn)一步在含敵百蟲濃度2000 mg/L的無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)一步純化。純化后的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,25℃恒溫培養(yǎng)24—48h后4℃冰箱保藏備用。

1.3 敵百蟲耐受菌株對(duì)敵百蟲的耐受性分析

采用陶樹興等[12]推薦的試管二倍稀釋法測(cè)定敵百蟲耐受菌株對(duì)敵百蟲的耐受性。將1000 mg/mL敵百蟲溶液分別加入含有2 mL無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中至終濃度為30720、15360、7680、3840、1920、960、480、240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24、0.12、0.06和0.03 mg/L, 同時(shí)以無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作為空白對(duì)照, 然后分別接種耐敵百蟲菌株的菌液至終濃度5.0×105cfu/mL,于25℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果, 把無菌生長(zhǎng)、稀釋度最大的敵百蟲的質(zhì)量濃度作為敵百蟲耐受菌株對(duì)敵百蟲的最大耐受濃度(Maximum tolerance concentration, MTC)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.4 敵百蟲耐受菌株的生理生化鑒定

參照黃志勇等[13]的方法, 采用生化微量發(fā)酵管對(duì)敵百蟲耐受菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5 敵百蟲耐受菌株16S序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

以敵百蟲耐受菌株的基因組DNA為模板, 對(duì)其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 其中正向引物為27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物為1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[14]。PCR的擴(kuò)增條件為： 94℃ 3min; 94℃ 1min, 60℃1min, 72℃ 1min, 共35個(gè)循環(huán)。敵百蟲耐受菌株的16S rRNA序列委托上海杰李生物技術(shù)有限公司完成, 并將其與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)后利用Mega 5.0軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Replications=1000, bootstrap值取百分比)。

1.6 敵百蟲耐受菌株的耐藥性分析

參照KB紙片擴(kuò)散法[15]測(cè)定敵百蟲耐受菌株的耐藥性, 并根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司提供的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》, 確定敵百蟲耐受菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。

1.7 敵百蟲耐受菌株對(duì)斑馬魚的安全性分析

試驗(yàn)設(shè)6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組, 每組健康斑馬魚10尾。試驗(yàn)組斑馬魚分別浸泡在終濃度為104—109cfu/mL敵百蟲耐受菌株的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中,對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中不添加敵百蟲耐受菌株。試驗(yàn)周期為8d, 試驗(yàn)期間對(duì)魚體反應(yīng)能力、游動(dòng)能力、呼吸能力等指標(biāo)進(jìn)行觀察, 記錄各組斑馬魚的死亡數(shù)目, 計(jì)算敵百蟲耐受菌株對(duì)斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行, 試驗(yàn)期間水溫控制在24—26℃、DO＞4 mg/L、pH 7.2。

1.8 敵百蟲耐受菌株對(duì)敵百蟲的解毒效果分析

參照《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》(GB/T 13267—1991)[10]進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組、3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組、1個(gè)陰性對(duì)照組和1個(gè)空白對(duì)照組, 每組健康斑馬魚20尾, 分別放置于規(guī)格為Φ225 mm×180 mm的圓形玻璃水族缸中。試驗(yàn)組在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中加入敵百蟲耐受菌株至終濃度1.0×106cfu/mL后立即加入終濃度為10、20和30 mg/L敵百蟲, 陽(yáng)性對(duì)照組在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中僅加入敵百蟲至終濃度10、20和30 mg/L, 陰性對(duì)照組在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中僅加入終濃度為1.0×106cfu/mL的敵百蟲耐受菌株, 空白對(duì)照組在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中不添加任何物質(zhì), 然后在試驗(yàn)開始后的24h、48h、72h和96h對(duì)魚體反應(yīng)能力、游動(dòng)能力、呼吸能力等指標(biāo)進(jìn)行觀察, 記錄各組斑馬魚的死亡數(shù)目, 計(jì)算敵百蟲在敵百蟲耐受菌株添加和不添加時(shí)對(duì)斑馬魚的LC50。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行, 試驗(yàn)期間水溫控制在24—26℃、DO＞4 mg/L、pH 7.2。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行處理分析, 以平均值±偏差表示。

2 結(jié)果

2.1 敵百蟲耐受菌優(yōu)良菌株的分離與篩選

從養(yǎng)殖污泥中分離了6株敵百蟲耐受菌, 分別暫命名為XR11、XR12、XR13、XR14、XR15和XR16, 通過進(jìn)一步測(cè)定比較其對(duì)敵百蟲的最大耐受濃度(圖1), 最終篩選出了菌株XR12為敵百蟲耐受菌的優(yōu)良菌株, 其對(duì)敵百蟲的最大耐受濃度達(dá)到了7680 mg/L, 分別是菌株XR11、XR13、XR14、XR15和XR16對(duì)敵百蟲最大耐受濃度的3倍(P＜0.05)、2倍(P＜0.05)、1.5倍(P＜0.05)、2.4倍(P＜0.05)和1.2倍(P＞0.05)。

2.2 敵百蟲耐受菌優(yōu)良菌株的鑒定

菌株XR12的生理生化鑒定結(jié)果(表1)表明, 菌株XR12能利用酒石酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、苯甲酸鈉、谷氨酸鈉、精氨酸鈉、乙酸鈉、延胡索酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、丙酮酸、丙三醇、甘露醇、乙醇, 不能利用半乳糖醇、硫代硫酸鈉, 與已報(bào)道[13,16]的類球紅細(xì)菌的生理生化特性一致。此外, 菌株XR12的16S rRNA序列(登錄號(hào)： MK156296)與GenBank中類球紅細(xì)菌菌株的16S rRNA序列有98%—100%的同源性(表2),菌株XR12的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)進(jìn)一步表明, 菌株XR12與類球紅細(xì)菌菌株RSF1 (登錄號(hào)： KF606891)的親緣關(guān)系最近。綜合生理生化特性以及16S rRNA序列分析的結(jié)果, 判定菌株XR12為類球紅細(xì)菌。

圖1 分離菌株對(duì)敵百蟲的最大耐受濃度Fig. 1 The maximum tolerance concentration of isolates against trichlorfon

2.3 敵百蟲耐受菌優(yōu)良菌株的耐藥性

菌株XR12對(duì)18種抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表3), 菌株XR12對(duì)卡那霉素、羅紅霉素、吡哌酸、阿莫西林、氟苯尼考、多黏菌素B、新霉素、慶大霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、奈替米星等14種抗生素高度敏感,對(duì)多西環(huán)素中度敏感, 對(duì)桿菌肽、萘啶酸、磺胺異噁唑等3種抗生素耐藥。

表1 菌株XR12的生理生化特征Tab. 1 Phenotypic characterization of strain XR12

2.4 敵百蟲耐受菌株對(duì)斑馬魚的安全性

菌株XR12以終濃度為104—109cfu/mL連續(xù)浸泡斑馬魚8d, 斑馬魚均未出現(xiàn)魚體反應(yīng)遲鈍、側(cè)翻、游動(dòng)和呼吸能力減弱以及死亡等不正?，F(xiàn)象,均生長(zhǎng)良好, 而且對(duì)照組中的斑馬魚也未出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象, 也生長(zhǎng)良好, 說明菌株XR12對(duì)斑馬魚的LC50大于109cfu/mL。

2.5 敵百蟲耐受菌株對(duì)敵百蟲的解毒效果

表4表明, 空白對(duì)照和僅添加菌株XR12的陰性對(duì)照組中斑馬魚均未出現(xiàn)魚體反應(yīng)遲鈍、側(cè)翻、游動(dòng)和呼吸能力減弱以及死亡等不正?，F(xiàn)象, 均生長(zhǎng)良好; 未添加菌株XR12的陽(yáng)性對(duì)照組中10—30 mg/L敵百蟲導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)18.3%—58.3%的死亡率,根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率(Y)與敵百蟲濃度(X)的關(guān)系曲線方程：Y=0.0559X+3.543, 敵百蟲在未加入XR12時(shí)對(duì)斑馬魚的96h-LC50為26.06 mg/L; 而添加菌株XR12的試驗(yàn)組中敵百蟲在終濃度為20和30 mg/L時(shí)分別導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)13.3%和20.0%的死亡率, 根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率(Y)與敵百蟲濃度(X)的關(guān)系曲線方程：Y=0.0285X+3.304, 敵百蟲在加入菌株XR12時(shí)對(duì)斑馬魚的96h-LC50為59.51 mg/L, 是未添加菌株XR12時(shí)敵百蟲對(duì)斑馬魚的96h-LC50的2.28倍, 說明菌株XR12能夠顯著降低敵百蟲對(duì)斑馬魚的毒性, 對(duì)敵百蟲具有良好的解毒效果。

3 討論

3.1 類球紅細(xì)菌的應(yīng)用價(jià)值

類球紅細(xì)菌是一種光合細(xì)菌, 具有廣泛的代謝方式, 能夠較好地利用低級(jí)脂肪酸、氨基酸和糖類等物質(zhì), 尤其是在厭氧、好氧、黑暗、光照條件下都能較好地生長(zhǎng)[17]。因此, 類球紅細(xì)菌是一種具有巨大開發(fā)潛力的水產(chǎn)益生菌[18]。目前, 類球紅細(xì)菌作為一種處理農(nóng)藥殘留污染的微生物, 已經(jīng)得到了學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。例如, 趙凱等[19]從土壤中分離了一株對(duì)敵敵畏具有良好降解效果的類球紅細(xì)菌EBL0706, 其在pH 6.9—7.5、溫度20—50℃條件下對(duì)400 mg/L敵敵畏的降解率達(dá)到了98%以上; 韓慶莉等[17,20]觀察了類球紅細(xì)菌CGMCC0645對(duì)敵敵畏暴露中鯽和斑馬魚的保護(hù)作用, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在20.0和35.0 mg/L敵敵畏暴露的養(yǎng)魚水中添加類球紅細(xì)菌(5×107cfu/mL)能夠?qū)Ⅵa的96h死亡率從40.0%和100.0%分別降至0和15%, 在28.3和33.6 mg/L敵敵畏暴露的養(yǎng)魚水中添加類球紅細(xì)菌(5×107cfu/mL)能夠?qū)唏R魚的96h死亡率從63.3%和96.7%降至0。這些類球紅細(xì)菌優(yōu)良菌株的獲得極大地豐富了環(huán)境中農(nóng)藥殘留生物處理的微生物資源。然而,從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來看, 類球紅細(xì)菌對(duì)敵百蟲的解毒研究的詳細(xì)報(bào)道卻極為匱乏。鑒此, 本實(shí)驗(yàn)從養(yǎng)殖污泥中分離篩選了一株優(yōu)良的敵百蟲耐受菌——類球紅細(xì)菌XR12, 確定了其分類地位, 分析了其藥敏特性、安全性與解毒效果, 豐富了敵百蟲污染治理的微生物資源。

表2 菌株XR12的16S rRNA序列與GenBank基因庫(kù)中已知類球紅細(xì)菌菌株16S rRNA序列同源性的比較Tab. 2 Homology comparison of 16S rRNA sequence of strain XR12 with the other R. sphaeroides strains in GenBank

圖2 基于菌株XR12及相關(guān)菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of strain XR12 and other related strains

3.2 類球紅細(xì)菌的鑒定

目前, 在細(xì)菌分類鑒定方法上, 生理生化鑒定和16S rRNA序列分析方法是細(xì)菌分類鑒定最常用的有效方法, 但這二種方法依然存在部分缺陷[21]。因此, 細(xì)菌分類鑒定必須將16S rRNA序列分析和生理生化鑒定兩種方法相結(jié)合, 以使鑒定方法更科學(xué),鑒定結(jié)果更可靠、更準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)菌株XR12進(jìn)行分類鑒定時(shí), 結(jié)合了生理生化特性和16S rRNA序列分析結(jié)果, 最終確定菌株XR12為類球紅細(xì)菌。然而, 菌株XR12與黃志勇等[13]從漁場(chǎng)底泥中分離的類球紅細(xì)菌菌株AS-32在葡萄糖酸鈉利用上的特性有所不同, 而且與GenBank中同源性較高的類球紅細(xì)菌菌株RSF1之間也存在一定的16S rRNA序列差異性, 這可能與類球紅細(xì)菌菌株之間的地理差異以及生長(zhǎng)環(huán)境條件不同有關(guān)[22]。

3.3 類球紅細(xì)菌的安全性

近年來, 益生菌引起人菌血癥、內(nèi)膜炎、肝膿腫等病例的報(bào)道[23], 使益生菌潛在的安全性評(píng)價(jià)成為一個(gè)不容忽視的問題。耐藥性是益生菌安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容的之一。為了避免益生菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的生長(zhǎng)受到限制, 所篩選的菌株應(yīng)該對(duì)大部分抗生素敏感[24]。目前, 紙片擴(kuò)散法是評(píng)價(jià)益生菌耐藥性的常用方法之一。王曉琳等[24]采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了芽孢桿菌益生菌BZ5的耐藥性, 發(fā)現(xiàn)菌株BZ5對(duì)苯唑西林、頭孢呋新、卡那霉素表現(xiàn)出耐藥性; 竇春萌等[25]采用紙片擴(kuò)散法分析了一株產(chǎn)消化酶能力強(qiáng)的夾膜紅細(xì)菌的耐藥性, 顯示該菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、卡那霉素、紅霉素、麥迪霉素等抗生素耐藥。本實(shí)驗(yàn)也采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)了菌株XR12的藥敏特性, 結(jié)果表明菌株XR12對(duì)83.3%實(shí)驗(yàn)選用的抗生素敏感或中度敏感, 因而滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌候選菌株關(guān)于藥物敏感性的基本要求。此外, 小規(guī)模浸泡試驗(yàn)是評(píng)價(jià)潛在益生菌株對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物安全性的良好方式[26]。王曉琳等[24]通過浸泡試驗(yàn)證實(shí)了芽孢桿菌BZ5和溶藻弧菌VZ5在濃度為106cfu/mL時(shí)對(duì)南美白對(duì)蝦的安全性。本實(shí)驗(yàn)也通過浸泡試驗(yàn)確定了菌株XR12在濃度為109cfu/mL時(shí)對(duì)模式生物-斑馬魚的安全性。因此, 菌株XR12具備在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的安全性。

表3 菌株XR12的藥敏特性Tab. 3 Antibiotic sensitivity of strain XR12

表4 敵百蟲在添加和不添加菌株XR12時(shí)對(duì)斑馬魚的急性毒性Tab. 4 Acute toxicity of trichlorphon to zebra fish under the presence and absence of strain XR12

3.4 類球紅細(xì)菌對(duì)敵百蟲的解毒作用

敵百蟲為膽堿酯酶抑制劑, 其對(duì)魚類的主要致毒作用是通過機(jī)體吸收后與腦突觸及肌肉神經(jīng)接點(diǎn)的膽堿酯酶相結(jié)合, 形成不易水解的磷?；憠A酯酶, 從而抑制膽堿酯酶的活性, 導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸內(nèi)蓄積, 致使神經(jīng)突觸傳導(dǎo)中斷, 引起神經(jīng)功能紊亂, 誘發(fā)中毒癥狀[27]。汪鵬鵬等[27]研究發(fā)現(xiàn),敵百蟲對(duì)斑馬魚的96h-LC50為27.88 mg/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 敵百蟲對(duì)斑馬魚的96h-LC50為26.06 mg/L, 與汪鵬鵬等[27]的試驗(yàn)結(jié)果稍有差異, 可能與斑馬魚的種類、規(guī)格不同有關(guān)[28], 但根據(jù)生態(tài)毒理學(xué)危害性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[29]： 極高,LC50≤1 mg/L; 高, 1＜LC50≤10 mg/L; 中, 10＜LC50≤100 mg/L; 低,LC50＞100 mg/L, 上述研究均證實(shí)敵百蟲對(duì)斑馬魚的危害等級(jí)屬于中級(jí), 這與敵百蟲能夠顯著抑制斑馬魚頭部乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)[27]。此外, 敵百蟲在酸性水體中可水解生成無毒的去甲基敵百蟲, 在堿性水體中可水解為毒性更強(qiáng)的敵敵畏, 后者可進(jìn)一步水解為對(duì)魚類具有毒害作用的磷酸二甲酯和二氯乙醛[30,31]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在試驗(yàn)水體pH (pH 7.2)沒有變化的情況下, 敵百蟲在添加菌株XR12時(shí)對(duì)斑馬魚的毒性顯著降低, 由此推斷菌株XR12能夠降解水中敵百蟲, 并且在解毒過程中沒有積累有毒的代謝產(chǎn)物。