王博 張強(qiáng) 李季 蘇小俊 倪維晨 張強(qiáng) 錢春桃

摘要：以徐筒玉絲瓜為試驗(yàn)材料，對(duì)絲瓜花粉先后分別進(jìn)行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy等不同劑量的γ射線輻照處理，通過對(duì)處理后花粉活力的表現(xiàn)、坐果情況以及瓜內(nèi)種子的比較，進(jìn)行花粉輻照處理后的效應(yīng)研究。結(jié)果表明，正常絲瓜的花粉活力為84.60%，授粉后坐果率為80%，經(jīng)過γ射線輻照后花粉活力、坐果率顯著降低，輻射劑量為250、400、500、750、1000Gy的處理，花粉活力變化幅度為45.19%～72.48%，坐果率變化幅度為10%～60%，且二者整體均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì);在1000Gy以上的高劑量輻照下，花粉活力降為50%以下，授粉后均不能坐瓜。對(duì)老瓜內(nèi)種子的比較發(fā)現(xiàn)，輻射劑量為250Gy處理時(shí)，種子外形飽滿與正常種子表現(xiàn)一致，發(fā)芽率達(dá)到84.50%，與正常種子發(fā)芽率85.25%相比差異不顯著;從400Gy處理開始，種子外形呈現(xiàn)干癟空殼狀且均不能萌發(fā)。研究結(jié)果表明，適合絲瓜輻射花粉授粉研究的劑量范圍應(yīng)該介于250～400Gy之間。本試驗(yàn)結(jié)果可為絲瓜輻射花粉誘導(dǎo)單倍體研究中花粉輻射劑量的選擇提供相關(guān)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：花粉輻照;花粉活力;坐果率;發(fā)芽率

中圖分類號(hào)：S642.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0135-04

作者簡(jiǎn)介：王博（1994—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閳@藝作物栽培和育種。E-mail：2018804177@njau.edu.cn。

通信作者：錢春桃，教授，研究方向?yàn)閳@藝作物栽培和育種。E-mail：chuntaoq@njau.edu.cn。

絲瓜（LuffacylindricaRoem.）為1年生葫蘆科絲瓜屬作物，起源于亞洲熱帶地區(qū)，在全世界共有8個(gè)種，我國(guó)主要有普通絲瓜和有棱絲瓜2個(gè)栽培種，是我國(guó)常見瓜類蔬菜之一[1-3]。絲瓜生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大對(duì)品種的培育提出了更高要求。目前，江蘇省乃至全國(guó)的絲瓜主要是常規(guī)育種，周期長(zhǎng)、效率不高，而利用雙單倍體（doublehaploid，DH）進(jìn)行育種可以縮短育種年限[4]。輻射花粉授粉和離體胚挽救技術(shù)是獲得葫蘆科作物雙單倍體的主要途徑之一[5]。

輻射花粉授粉是通過物理誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)植株體內(nèi)的雌核發(fā)生，使未受精的胚囊細(xì)胞發(fā)育成胚，形成單倍體或雙單倍體材料[4]。目前，輻射花粉技術(shù)培養(yǎng)單倍體已在黃瓜[6]、甜瓜[7]、西瓜[8]等葫蘆科作物上廣為研究，楊泗海對(duì)絲瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的胚培養(yǎng)環(huán)節(jié)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)展開了研究[9]，但是絲瓜輻射花粉誘導(dǎo)單/雙單倍體的研究目前尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)于絲瓜輻射花粉劑量效應(yīng)的探索是整個(gè)輻射花粉途徑，是一項(xiàng)必要的誘導(dǎo)培育絲瓜單倍體研究的基礎(chǔ)工作，為了高效誘導(dǎo)絲瓜單倍體，確定適宜的輻射劑量非常重要[10]。在已有的葫蘆科作物黃瓜[6]、甜瓜[7]輻射花粉誘導(dǎo)單倍體的研究中，適宜的輻射劑量為200～350Gy。在甜瓜上，研究者一般設(shè)定的輻射劑量范圍為150～2500Gy[11～15]，因此在本研究中設(shè)計(jì)了10個(gè)劑量處理，分別為250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（常熟）新農(nóng)村發(fā)展研究院4號(hào)大棚內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)材料主要為徐筒玉絲瓜品種，于2019年春季3月中旬播種，采用電熱溫床育苗，4月1日定植于大棚內(nèi)，定植后進(jìn)行常規(guī)栽培管理。試驗(yàn)配套的器材用具主要包括用于保存花粉的防曬泡沫保溫箱、冰盒、冰塊等。

1.2方法

1.2.1輻射處理

試驗(yàn)于2019年6—8月進(jìn)行，在蘇州大學(xué)獨(dú)墅湖校區(qū)906幢輻照中心進(jìn)行，輻射前1d下午套雄花，輻射當(dāng)天早晨取雄花置于冰盒中，分別進(jìn)行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy的γ射線輻照處理，每個(gè)劑量處理時(shí)間均為60min。

1.2.2花粉活力測(cè)定

取輻射當(dāng)天各個(gè)劑量的花粉，參照張琛等研究中利用TTC法進(jìn)行活力測(cè)定的方法[16]設(shè)計(jì)花粉活力測(cè)定試驗(yàn)，具體操作步驟為：取各個(gè)劑量花粉少許放在干潔的載玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，攪勻后蓋上蓋玻片，并用清水作對(duì)照。置35℃恒溫箱中，30min后鏡檢，凡被染為紅色的花粉活力強(qiáng)，淡紅次之，無色者為沒有活力或不育花粉。每片取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。

1.2.3輻射花粉授粉及性狀統(tǒng)計(jì)

輻射當(dāng)天下午套雌花，第2天早晨進(jìn)行各個(gè)劑量輻射花粉的授粉工作，每個(gè)輻射劑量授10朵雌花，授粉后進(jìn)行常規(guī)的栽培管理。至商品瓜時(shí)期即授粉后10d，對(duì)坐果率進(jìn)行統(tǒng)計(jì);授粉后50d，取得到的老瓜內(nèi)種子進(jìn)行形態(tài)觀察以及種子的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。種子的萌發(fā)率測(cè)定參照黃樹蘋等研究中絲瓜種子發(fā)芽率的測(cè)定方法[17]，具體操作步驟為：將各個(gè)輻射劑量處理的瓜內(nèi)種子各挑出100粒，每個(gè)處理4次重復(fù)，起始采用50℃左右溫水浸種15min，此后置于清水中浸泡12h，并且每間隔4h換1次清水，浸種結(jié)束后用毛巾包裹放在30℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽。催芽期間分別于早上和晚上將種子拿出透氣并清洗毛巾和種子。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法：發(fā)芽率=8d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同輻射劑量對(duì)花粉活力的影響

從表1可以看出，花粉活力隨著輻射劑量的增大整體呈現(xiàn)下降的態(tài)勢(shì)，僅在500、1250、1500Gy下處理出現(xiàn)反常，對(duì)應(yīng)的花粉活力出現(xiàn)相應(yīng)小幅度回升。未經(jīng)輻射的花粉活力很強(qiáng)，達(dá)84.60%，而經(jīng)輻射過的花粉活力變化幅度在18.28%～72.48%之間，各個(gè)劑量的輻射花粉的活力均低于未經(jīng)輻射的花粉，差異均達(dá)顯著水平，說明輻射能夠顯著降低絲瓜的花粉活力。當(dāng)輻射劑量為250、400、500、750Gy時(shí)，花粉活力均在50%以上;輻射劑量為1000、1250、1500、1600Gy的處理，花粉活力已降低至50%以下，當(dāng)輻射劑量達(dá)到1750Gy時(shí)，花粉活力下降至22.83%，不足30%;當(dāng)輻射劑量為2000Gy時(shí)，花粉活力降低至18.28%，不足20%，說明輻射會(huì)在一定程度上降低絲瓜的花粉活力，且劑量越大，降低的效應(yīng)越明顯。

2.2不同輻射劑量對(duì)坐果率的影響

從表2可以看出，正常授粉的絲瓜坐果率達(dá)到80%，輻射花粉授粉的絲瓜坐果率變化幅度在0～60%之間，比較而言，輻射花粉授粉的瓜坐果率均低于正常授粉的絲瓜，說明輻射花粉對(duì)絲瓜的坐果率有一定的影響。當(dāng)輻射劑量為250、400、500、750、1000Gy時(shí)，坐果率依次下降，輻射劑量為1000Gy的處理，坐瓜率僅為10%，輻射劑量高于1000Gy均不能坐果。表明在一定輻射劑量范圍內(nèi)，輻射花粉授粉會(huì)使絲瓜的坐果率降低，且高劑量的輻射花粉授粉會(huì)嚴(yán)重影響絲瓜的坐果率。

2.3不同輻射劑量下老瓜內(nèi)種子的比較

試驗(yàn)中輻射劑量高于1000Gy時(shí)均未能坐瓜，

[FK（W15][HT6H][JZ]表1不同輻射劑量下絲瓜的花粉活力并未得到種子，對(duì)其他輻射劑量得到種子的觀察結(jié)果如圖1所示，正?；ǚ凼诜鄣墓蟽?nèi)種子為黑色種皮，種子飽滿，外形呈橢圓狀，輻射劑量為250Gy的處理與正常花粉授粉的瓜種子外觀上與正常瓜種子相似，無明顯差別（圖1-a、圖1-b）;輻射劑量為400、500、750、1000Gy的處理瓜內(nèi)種子外觀相似，均為橢圓狀干癟空殼的種子（圖1-c、圖1-d、圖1-e、圖1-f）。對(duì)這些得到的種子發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

從表3可以看出，正常授粉的瓜內(nèi)種子發(fā)芽率為85.25%，輻射劑量為250Gy處理的發(fā)芽率為84.50%，二者之間差異不顯著，而輻射劑量為400、500、750、1000Gy處理的瓜內(nèi)種子均未能萌發(fā)。綜合種子外觀比較而言，250Gy的劑量處理下瓜內(nèi)形成的種子為發(fā)芽率正常的絲瓜種子，而400Gy及以上的劑量處理瓜內(nèi)形成的種子是干癟空殼狀、不能正常萌發(fā)的種子。

3討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，輻射導(dǎo)致絲瓜花粉活力顯著降低，且隨著輻射劑量的增大，花粉活力降低得越明顯，在本研究中1750、2000Gy高劑量處理的花粉活力降低至30%以下，這可能是由于輻射破壞了花粉細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[18]，從而導(dǎo)致花粉細(xì)胞活力降低，進(jìn)而使得花粉表現(xiàn)出來的活力下降，試驗(yàn)結(jié)果表明，劑量越大，花粉活力越低，說明高劑量輻射給花粉細(xì)胞帶來的傷害作用越明顯。

從坐果情況來看，輻射花粉授粉后，坐果率相比正常絲瓜均降低，且劑量越大，坐果率越低，當(dāng)輻射劑量超過1000Gy后絲瓜已很難坐果，這可能是由于輻射后花粉活力降低導(dǎo)致的。曾輝等研究認(rèn)為，花粉活力與坐果率的高低直接相關(guān)[19]。在薛浩等關(guān)于甜瓜輻射花粉的研究結(jié)論中，輻射劑量在200～1500Gy時(shí)，對(duì)坐果率沒有明顯的影響;而在2000Gy時(shí)，坐果率明顯降低[10]，本研究結(jié)果與之不完全一致，可能是由于試驗(yàn)材料的不同所致。Visser等認(rèn)為，輻射劑量與植物的倍性、花粉粒的大小有關(guān)，倍性越高、花粉粒越小，越耐輻射[20-21]，對(duì)于絲瓜來說，其花粉粒比甜瓜要大，因此相比甜瓜不耐輻射，所以才會(huì)出現(xiàn)輻射后花粉活力、坐果率均顯著降低的結(jié)果。

從收得的老瓜種子來看，250Gy的劑量輻照形成的種子在形態(tài)和萌發(fā)率上與正常種子相比均無較大差別，而400Gy及以上的劑量輻射形成的種子均為干癟空殼，且這些種子均不能正常萌發(fā)，說明400Gy的劑量輻射已不足以使絲瓜形成正常種子，由此可推測(cè)適合絲瓜輻射花粉授粉研究的劑量范圍應(yīng)該在250～400Gy之間，本結(jié)論與張永兵等關(guān)于輻射花粉誘導(dǎo)甜瓜單倍體的研究中“適宜誘導(dǎo)培育單倍體劑量為300Gy”的結(jié)論[13]相似。今后將在250～400Gy之間設(shè)計(jì)更為精細(xì)的劑量篩選試驗(yàn)，并結(jié)合胚拯救技術(shù)，開展絲瓜單倍體的培育研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]舒迎瀾.主要瓜類蔬菜栽培簡(jiǎn)史[J].中國(guó)農(nóng)史，1998，17（3）：94-99.

[2]林琿，陳朝文，溫慶放，等.絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J].分子植物育種，2017，15（9）：3759-3766.

[3]王青青，王天文，高安輝.絲瓜種質(zhì)資源與育種研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代園藝，2019（21）：33-35.

[4]付文苑，唐兵，鄧英，等.輻射花粉授粉誘導(dǎo)黃瓜單倍體及染色體加倍[J].分子植物育種，2019，17（21）：7150-7155.

[5]黃金華，董彥琪，劉喜存，等.葫蘆科蔬菜單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展——花粉輻射和離體胚挽救技術(shù)[J].中國(guó)瓜菜，2016，29（6）：1-4.

[6]雷春，陳勁楓，錢春桃，等.輻射花粉授粉和胚培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生黃瓜單倍體植株[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（9）：1739-1743.

[7]郭鳳領(lǐng)，戴照義，鄧曉輝，等.輻射花粉誘導(dǎo)甜瓜單倍體的研究[C]//園藝植物染色體倍性操作與遺傳改良學(xué)術(shù)研討會(huì).重慶：中國(guó)園藝學(xué)會(huì)，2012.

[8]楊紅，顧妍，張朝陽，等.輻射花粉授粉誘導(dǎo)西瓜單倍體[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（22）：159-161.

[9]楊泗海.一種絲瓜未受精子房誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法：CN201910725097.5[P].2019-09-27.

[10]薛皓，王建設(shè)，徐世才，等.甜瓜輻射花粉誘導(dǎo)單倍體的影響因素研究[J].長(zhǎng)江蔬菜，2008（24）：7-10.

[11]LotfiM，AlanAR，HenningMJ，etal.Productionofhaploidanddoubledhaploidplantsofmelon（CucumismeloL.）foruseinbreedingformultiplevirusresistance[J].PlantCellReports，2003，21（11）：1121-1128.

[12]SautonA，deVaulxRD.Obtentiondeplantshaploidschezslemelon（CucumismeloL.）pargynogenesisinduitepardupollenirradie[J].Agronomie，1987（7）：141-148.

[13]張永兵，陳勁楓，伊鴻平，等.輻射花粉授粉誘導(dǎo)甜瓜單倍體[J].果樹學(xué)報(bào)，2006，23（6）：892-895.

[14]CunyF，GrotteM，VaulxRD，etal.Effectsofgammairradiationofpollenonparthenogenetichaploidproductioninmuskmelon（CucumismeloL.）[J].EnvironmentalandExperimentalBotany，1993，33（2）：301-312.

[15]孫玉宏，梅時(shí)勇，彭金光，等.甜瓜胚搶救最佳時(shí)間的確定[J].長(zhǎng)江蔬菜，2006（4）：43-44.

[16]張琛，郗篤雋，裴嘉博，等.時(shí)長(zhǎng)和染色法對(duì)TTC法測(cè)定甜櫻桃花粉活力的影響[J].杭州農(nóng)業(yè)與科技，2019（5）：29-30.

[17]黃樹蘋，徐長(zhǎng)城，談杰，等.不同處理對(duì)鄂絲瓜1號(hào)種子萌發(fā)特性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：25-27.

[18]岳潔瑜.N+、α粒子、60Co-γ對(duì)陸地棉花粉的誘變效應(yīng)研究及誘變后代鑒定[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[19]曾輝，楊為海，林文秋，等.花粉活力對(duì)澳洲堅(jiān)果初始坐果率的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（1）：72-76.

[20]VisserT，OostEH.PollenandpollinationexperimentsⅢ.theviabilityofappleandpearpollenasaffectedbyirradiationandstorage[J].Euphytica，1981，30（1）：65-70.

[21]DenissenCM，NijsAD.EffectsofgammairradiationoninvitropollengerminationofdifferentCucumisspecies[J].Euphytica，1987，36（2）：651-658.