摘要：在沒有參考基因組的情況下，為了揭示川百合（Liliumdavidii）在4℃處理下基因表達(dá)譜的變化，為百合抗寒育種、引種及栽培提供理論支撐及技術(shù)支持。采用高通量IlluminaHiseq測序平臺對川百合20℃（對照組）與4℃（處理組）溫度條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析研究，進(jìn)一步探究川百合寒冷應(yīng)答的分子機制。結(jié)果表明，經(jīng)富集分析后得，與光合作用、光合作用-天線蛋白、光合生物體中的碳固定、葉綠素代謝等相關(guān)的基因可以作為研究川百合寒冷響應(yīng)機制的主要研究對象。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析結(jié)果表明，隨機選出的10個差異性表達(dá)基因的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致。這為川百合響應(yīng)低溫相關(guān)基因的發(fā)掘與利用、川百合耐寒分子機制的揭示及百合種植資源遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：川百合;驟然低溫;轉(zhuǎn)錄組;分子機制;抗寒通路

中圖分類號：S644.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0028-09

作者簡介：田雪慧（1978—），女，陜西周至人，博士，副教授，主要從事花卉生產(chǎn)與應(yīng)用方面的教學(xué)與科研工作。E-mail：txh_1214@163.com。

自然界中植物經(jīng)常遭受干旱[1-4]、髙鹽[5]、高溫[6]和寒害[7-8]等生物或非生物脅迫，溫度是影響植物生長發(fā)育與分布的主要決定性因素[9-11]，環(huán)境溫度低于植物正常生長的溫度會嚴(yán)重影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[12-14]，尤其是在早春和深秋時，溫度突然降低會引起植物體內(nèi)一系列變化。有學(xué)者報道稱在許多植物中已經(jīng)觀察到其對低溫脅迫的分子響應(yīng)，包括基因表達(dá)[15]、氧化還原態(tài)[16]和復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。但有關(guān)低溫對百合影響的研究大多集中在百合鱗莖采收后休眠生理（春化）期的低溫需求，而對其營養(yǎng)生長期的研究較少[8，19-20]。營養(yǎng)生長是百合鱗莖生長糖分積累的關(guān)鍵，因此研究冷脅迫對營養(yǎng)生長的影響具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組測序作為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究工具，功能強大、廣受歡迎，在動植物中被廣泛地應(yīng)用于分析生物體在特定生物學(xué)過程中mRNA表達(dá)，揭示其內(nèi)在的分子機制[21-22]。到目前為止，人們對許多植物的低溫脅迫轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行了大量的研究，包括卷單百合[4]、鐵炮百合[23]等。這些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量參與適應(yīng)低溫變化的冷應(yīng)激相關(guān)基因[24]。然而，對食用百合研究較少，特別是川百合（LiliumdavidiiDuchartreexElwes）的研究至今還是空白。

[JP2]百合是一種藥食同源植物，也是著名的觀賞植物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。川百合是一個優(yōu)良的食用百合品種，生長在甘肅省蘭州市七里河區(qū)，海拔超過2000m，白天的平均最高溫度低于4℃，川百合耐寒性明顯高于其他食用百合品種[23]。因此，揭示川百合抗寒的分子機制具有重要意義，可為食用百合的高質(zhì)量生產(chǎn)栽培及遺傳育種提供依據(jù)。本研究以川百合為材料，以常溫（20℃）為對照，低溫（4℃）條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，目的是（1）根據(jù)基因本體論和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，探討低溫反應(yīng)最豐富的通路;（2）鑒定光合作用及抗氧化相關(guān)基因。研究川百合抗寒的分子機制，有助于進(jìn)一步了解食用百合是如何適應(yīng)或不能適應(yīng)環(huán)境變化的。

1材料與方法

1.1試驗材料

收集甘肅省蘭州市七里河區(qū)室外生長的成熟百合鱗莖，在2℃冰箱中保存110d。春化后，將鱗莖移栽于體積為2L直徑為15cm的花盆中，置于（20℃）人工智能氣候箱中。生長環(huán)境溫度設(shè)置為白天20℃、夜晚15℃，相對空氣濕度為50%～65%，光—暗周期為16h—8h，平均光照度為（350±20）μmol/（m2·s），每3～5d澆灌300mL水，用霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液為其提供充足養(yǎng)分。

1.2低溫脅迫處理

將長勢良好高度約15cm的川百合幼苗，在2個人工智能氣候箱作不同溫度處理（每室12株）。一室為對照，溫度設(shè)為20℃，另一室為低溫處理，溫度設(shè)為4℃，其他環(huán)境參數(shù)與前處理相同。處理24h后取相同部位的葉片，液氮速凍，-80℃保存。

1.3指標(biāo)測定

1.3.1轉(zhuǎn)錄測序

每室各取3份川百合葉片樣品，采用TRIzol法提取總RNA[25]，并對其純度、完整性、濃度等進(jìn)行檢測，檢測合格的樣品用磁珠富集mRNA[25]，再將mRNA打成短片段后合成第二鏈cDNA，修復(fù)、純化、選擇片段大小，然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，得到最終文庫。高通量測序平臺選用Illumina4000[25]，測序所得的數(shù)據(jù)稱為rawreads或rawdata。對結(jié)果進(jìn)行組裝、拼接，并進(jìn)行功能注釋和表達(dá)水平分析。

1.3.2PCR驗證

以川百合葉片RNA為材料，采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計引物（表1）進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析，以Actin基因作為內(nèi)參[26]，隨機選取10個差異基因進(jìn)行驗證。

1.4數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1測序結(jié)果與Trinity拼接

由表2可知，對照組產(chǎn)生了868404526個原始序列，84782272個純凈序列，堿基含量為44.84%;處理組產(chǎn)生了74630164個原始序列，72715608個純凈序列，堿基含量為50.03%。這些結(jié)果表明川百合的轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可進(jìn)行后續(xù)研究。

由表3可知，轉(zhuǎn)錄本共產(chǎn)生168637667個堿基，共產(chǎn)生133179110個單基因序列（約為轉(zhuǎn)錄本的79%）。單基因序列值高達(dá)轉(zhuǎn)錄序列的90%以上（核苷酸總數(shù)除外）。說明拼接良好，RNA質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2基因功能注釋結(jié)果

如表4所示，所有基因中，有238301個基因被注釋到相應(yīng)的7個數(shù)據(jù)庫中。其中，約27.41%的基因（65314個基因）被注釋到NR庫（NCBI蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫），17.68%的基因（42138個基因）被注釋到COG/KOG庫（真核生物的同源基因數(shù)據(jù)庫），14.79%的基因（35244個基因）被注釋到GO庫，15.91%的基因（37916個基因）被注釋到Nt庫（[CM（21*3]核酸序列數(shù)據(jù)庫），19.44%的基因（46337個基因）被注釋到Swiss-Prot，24.59%的基因（58605個基因）被注釋到包含了（數(shù)據(jù)庫）的蛋白質(zhì)家族。其他無法注釋到數(shù)據(jù)庫中的基因可能是由于基因片段過短或數(shù)據(jù)庫中信息缺乏等原因。

將GO、KEGG、KOG中注釋的基因進(jìn)行分類，評價組裝后基因的功能（圖1）。GO分類中，將基因分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3組，在分子功能中，“結(jié)合活性（binding）”和“催化活性（catalyticactivity）”的基團(tuán)最多（圖1-a）;為了進(jìn)行KOG函數(shù)的分類，將所有基因分類為26個亞類，“一般功能預(yù)測（generalfunctionpredictiononly）”的聚類最多（圖1-b）;KEGG分類中，5組基因均有表達(dá)，代謝組中，“全球概覽圖（globalandoverviewmaps）”“轉(zhuǎn)錄（Translation）”和“碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）”的聚類顯著豐富，分別有1730、1592、1127個基因（圖1-c）。結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)了一系列涉及生物過程、細(xì)胞組分、分子功能、代謝等不同亞類的單基因顯著富集。

2.3基因表達(dá)差異分析

2.3.1GO富集分析

將所有差異基因進(jìn)行GO富集分析后，上調(diào)基因富集結(jié)果如圖2所示，在細(xì)胞組分中，富集效果較明顯的功能有細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核;分子功能中富集效果較明顯的功能有蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性;生物過程中富集效果較明顯的功能有磷代謝過程、復(fù)合磷酸鹽代謝過程、磷酸化作用、蛋白磷酸化。結(jié)果表明上調(diào)差異基因在細(xì)胞成分、分子功能、生物過程等3個方面主要調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成代謝。

下調(diào)基因富集分析結(jié)果如圖3所示，細(xì)胞成分功能中富集較為明顯的是光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心;分子功能中富集較為明顯的是水解酶活性、電子運輸活動等。生物過程功能中富集較為明顯的是光合作用、光反應(yīng)等。因此，下調(diào)基因在細(xì)胞組分、分子功能、生物過程3個方面主要調(diào)節(jié)光合作用。

2.3.2KEGG富集分析分析結(jié)果如圖4所示，上調(diào)差異基因顯著富集的通路有植物生理節(jié)律（circadianrhythm-plant），苯丙氨酸代謝（phenylalaninemetabolism），真核生物核糖體生物合成（ribosomebiogenesisineukaryotes），甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和β-氨基酸代謝（glycine，serineandthreoninemetabolism），黃酮類化合物（flavonoidbiosynthesis）、氨基酸類的生物合成（biosynthesisofaminoacids），植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（planthormonesignaltransduction）等。上調(diào)差異基因c168304_g1、c148234_g1、c168304_g3、c168304_g2、c166080_g1（EC：4.3.1.24）、c165806_g1（EC：1.14.13.11）等主要調(diào)節(jié)氨基酸代謝;c169999_g5（pseudo-responseregulator5）、c174283_g3等主要調(diào)節(jié)植物生理節(jié)律;c152959_g1和c146280_g1（EC：5.4.9.9）主要調(diào)節(jié)真核生物核糖體合成;c151401_g1、c146896_g1、c146896_g3、c174513_g3、c174513_g1、c155146_g1和c169857_g1（EC：2.3.1.74）主要調(diào)節(jié)黃酮類化合物的合成;c163360_g1主要調(diào)節(jié)植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

下調(diào)基因顯著富集的通路有光合作用、光合作用[CM（21]-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝、光合生物碳固定等（如圖5所示）。下調(diào)基因c198283_g1和c153649_g1主要調(diào)節(jié)光反應(yīng)系統(tǒng)，c149445_g1、c115377_g1、c167947_g1和c170780_g1（EC：1.2.1.70）主要調(diào)節(jié)葉綠素代謝，c169641_g1（EC：1.1.1.37）主要調(diào)節(jié)碳固定。因此，下調(diào)基因通過調(diào)節(jié)光反應(yīng)系統(tǒng)和葉綠素的合成，從而調(diào)節(jié)光合作用。

2.4qRT-PCR驗證

為驗證測序結(jié)果的可信度，隨機選取10個差異基因，其中5個上調(diào)基因（c111268_g1、c145664_g1、c145507_g1、c128115_g1），5個下調(diào)基因（c117236_g1、c119413_g2、c135104_g1、c93924_g1），以Actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR驗證。由圖6可知，10個基因在不同溫度下的表達(dá)程度不同，但表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果一致，則表明測序結(jié)果真實可靠。

3討論與結(jié)論

冷脅迫指植物暴露在較低但不結(jié)冰的溫度下而導(dǎo)致的損傷[26]，生長期間突然出現(xiàn)的低溫嚴(yán)重影響百合的生長。本研究對川百合抗寒性相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選和驗證，可以為川百合簡單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）的開發(fā)和分子育種提供參考。

之前的研究表明，低溫脅迫引起百合幼苗體內(nèi)生理生化水平發(fā)生了巨大的變化[18]，表明川百合在其營養(yǎng)生長早期對4℃低溫較為敏感。本研究比較了川百合在常溫和低溫下的代謝情況，闡明了川百合具有獨特的抗寒機制。冷應(yīng)激誘導(dǎo)豐富度的結(jié)果（圖3）表明，它可能導(dǎo)致分子水平上的許多代謝過程，從而提供低溫脅迫條件下可能的分子機制。

將基因分為GO、KEGG、KOG等不同類別（圖2），在分子功能方面，發(fā)現(xiàn)“結(jié)合活性（binding）”和“催化活性（catalyticcativity）”是最常見的2個基團(tuán)（圖2-a），這些基因包括結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運體活性的形成[27]，影響植物的代謝過程。同時還發(fā)現(xiàn)，在代謝組KEGG數(shù)據(jù)庫，碳水化合物代謝、維生素代謝、能量代謝等代謝通路的差異表達(dá)基因最豐富[CM（21]，人們普遍認(rèn)為，這些通路是抑制其生長和發(fā)育的內(nèi)在代謝通路。從整體上看，KEGG數(shù)據(jù)庫中響應(yīng)低溫脅迫的基因非常豐富，[JP3]須要深入挖掘其分子機制。

基于GO和KEGG分析的低溫與常溫下富集最豐富的通路分別如圖4和圖5所示，包括上調(diào)通路和下調(diào)通路。研究表明，細(xì)胞成分（胞內(nèi)膜內(nèi)和膜內(nèi)細(xì)胞器）中與膜相關(guān)的通路顯著上調(diào)（圖4），膜對冷應(yīng)激反應(yīng)顯著。此外，在GOterm的生物學(xué)過程中，磷酸化和蛋白磷酸化通路在低溫脅迫下顯著上調(diào)，這可能是因為磷是膜的重要成分，這與Moellering等的研究[28]相同。此外，葉片對水的響應(yīng)和對非生物刺激的響應(yīng)途徑顯著上調(diào)，因為低溫下葉片的相對含水量會降低[29];與光合作用相關(guān)的通路（光合作用、光收獲、光合作用、光反應(yīng)）顯著下調(diào)，與許多以前的報道和目前關(guān)于低溫下光合作用響應(yīng)的研究數(shù)據(jù)[30]一致。

為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選擇了10個與光合作用、代謝途徑、代謝途徑和氧化磷酸化相關(guān)的基因，采用qRT-PCR方法檢測其相對表達(dá)（圖6）。結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)吻合較好，說明RNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的，可以用來揭示川百合對低溫反應(yīng)的分子機制。

低溫（4℃）脅迫顯著降低了川百合細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。通過轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出與抗寒性、光合作用、代謝途徑等相關(guān)的關(guān)鍵基因，為川百合SSR的開發(fā)和分子育種提供了參考。川百合抗寒相關(guān)基因、代謝物及途徑還有待進(jìn)一步研究。

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