崔倩倩，劉朝陽(yáng)

(1.中冶華天工程技術(shù)有限公司，210019，南京；2. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，210008，南京)

0 引言

石油工業(yè)是重要戰(zhàn)略能源與國(guó)民經(jīng)濟(jì)命脈，受到全世界各國(guó)極度重視。然而隨著石油工業(yè)快速發(fā)展，石油污染問(wèn)題逐步引起人們廣泛關(guān)注。在石油開(kāi)采、煉制、加工、運(yùn)輸及使用過(guò)程中出現(xiàn)的原油泄漏與溢油事故，嚴(yán)重污染了當(dāng)?shù)赝寥篮退w。石油污染會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)和功能，從而影響其透氣性和滲水性，造成土壤肥力下降、土壤板結(jié)等問(wèn)題；石油漂浮在水面會(huì)形成油膜，造成水體溶氧量降低，影響水生生物生長(zhǎng)發(fā)育甚至造成缺氧死亡，嚴(yán)重破壞水生生態(tài)系統(tǒng)；同時(shí)石油及其產(chǎn)品中的一些揮發(fā)性成分可與大氣中的顆粒物結(jié)合，伴隨著降雨或者降塵進(jìn)入土壤和水體中，導(dǎo)致石油污染傳輸擴(kuò)散。據(jù)估計(jì)全世界每年約有 10億 t石油及其產(chǎn)品進(jìn)入地下水、地表水及土壤中，對(duì)自然環(huán)境、人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面造成了嚴(yán)重影響[1]。

石油是一種多成分復(fù)雜化合物，由多種烴類(lèi)和非烴類(lèi)組成，烴類(lèi)物質(zhì)是石油主要成分，約占石油總成分的95%～99%。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，石油烴類(lèi)物質(zhì)可分為烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等幾種類(lèi)別，其中烷烴占石油中含量的50%～95%，為石油烴中主要成分[2-3]。近年來(lái)隨著環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，綠色高效、無(wú)二次污染、對(duì)環(huán)境友好及成本低廉的微生物修復(fù)技術(shù)得到重視，逐步被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用與關(guān)注。

1 可修復(fù)石油烴類(lèi)污染的微生物種類(lèi)

據(jù)報(bào)道已有100多個(gè)屬200多種可降解石油烴的微生物被發(fā)現(xiàn)。報(bào)道較多的微生物種類(lèi)有細(xì)菌(不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬等)、真菌(金色擔(dān)子菌、紅酵母屬、假絲酵母屬等)、放線菌(分支桿菌屬、諾卡氏菌屬、放線菌屬等)、酵母等；其中細(xì)菌分離得到的種類(lèi)最多、應(yīng)用最廣，一般認(rèn)為比其他菌屬的石油降解效果更好[4]。微生物降解石油烴是需要多種微生物協(xié)同作用的復(fù)雜過(guò)程，可培養(yǎng)的微生物在自然界中仍占少數(shù)，所以可降解石油烴的微生物篩選、分離和培養(yǎng)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題。

發(fā)生石油污染后，石油烴降解菌能比較快速地適應(yīng)受石油污染的環(huán)境，并進(jìn)行大量繁殖，聚集形成降解效率較高、修復(fù)能力較強(qiáng)的微生物菌群[5-6]。1989年美國(guó)阿拉斯加威廉王子灣發(fā)生郵輪泄漏3.55 萬(wàn)t原油入海洋后，Braddock[7]等連續(xù)3年發(fā)現(xiàn)石油烴降解菌數(shù)量在油膜覆蓋區(qū)域遠(yuǎn)高于非油膜覆蓋區(qū)域。El-Sheshtawy[8]等從被石油污染的埃及紅海吉薩灣分離得到15種石油烴降解菌。利用石油烴降解菌能夠快速響應(yīng)石油污染的特性，通過(guò)特定石油烴基質(zhì)富集培養(yǎng)、誘導(dǎo)等人工方式可以獲取豐富的石油烴降解菌資源，這些微生物的活性和降解能力均優(yōu)于非石油污染區(qū)域的微生物。李曉娜[9]等從山東省東營(yíng)市勝利油田附近被石油污染的土壤中分離得到兩株高效降解菌，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌和假單胞菌，2株菌對(duì)石油的降解率分別可達(dá)到72.3%和61.2%，具有應(yīng)用于石油類(lèi)污染修復(fù)的潛力。

2 石油烴污染的微生物修復(fù)技術(shù)

微生物修復(fù)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于治理石油烴污染。微生物可以烴類(lèi)化合物為能源，在正常生理代謝過(guò)程中降解石油烴類(lèi)污染物。微生物修復(fù)技術(shù)一般分為原位微生物修復(fù)和異位微生物修復(fù)2種。原位微生物修復(fù)是直接利用微生物在發(fā)生污染的區(qū)域進(jìn)行修復(fù)；異位修復(fù)則是將受污染的物料轉(zhuǎn)運(yùn)至其他地方，再通過(guò)微生物進(jìn)行修復(fù)的技術(shù)[10]。與異位微生物修復(fù)相比，原位微生物修復(fù)是一種低維護(hù)、低成本、環(huán)保且可持續(xù)的治理方法。

2.1 生物強(qiáng)化技術(shù)

外源添加經(jīng)過(guò)篩選馴化的高效降解菌或者直接將降解菌接種到受污染的區(qū)域，在適宜微生物生長(zhǎng)代謝的環(huán)境條件下用于降解石油烴類(lèi)物質(zhì)的技術(shù)被稱(chēng)為生物強(qiáng)化技術(shù)[11]。該技術(shù)中所用高效降解菌種一般都從受石油烴污染樣品馴化篩選得到，具有適應(yīng)性強(qiáng)、可持續(xù)發(fā)揮修復(fù)作用的特點(diǎn)，具有較好修復(fù)能力。生物強(qiáng)化技術(shù)主要包含外源投加高效降解菌同時(shí)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、表面活性劑、增加曝氣量等措施。雖然該技術(shù)在石油烴類(lèi)污染治理中表現(xiàn)出較好的效果，但是容易受環(huán)境條件和土壤理化性質(zhì)影響，在應(yīng)用上有一定的局限性[11-12]。研究更高效的生物強(qiáng)化配套措施是未來(lái)主要發(fā)展趨勢(shì)。

2.1.1 投加外源微生物 在外源加入石油烴降解菌時(shí)，需要考察外源微生物與土著微生物的關(guān)系，考慮選擇相容性好，與土著微生物之間可發(fā)揮協(xié)同互補(bǔ)關(guān)系，避免外源微生物與土著微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，助力降解菌株發(fā)揮最大修復(fù)潛力[12]。最常用的方法是將從石油污染的樣品中篩選得到的降解菌制成微生物菌劑外源投加進(jìn)行修復(fù)。隋紅[13]等通過(guò)投加研發(fā)的微生物菌劑進(jìn)行土壤修復(fù)試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)2個(gè)月的修復(fù)處理，受污染的土壤中總石油烴含量由334 mg/kg降為91 mg/kg。Alisi[14]等外源投加由10種石油烷烴降解菌組成的微生物菌劑ENEA-LAM可降解土壤中75%以上的柴油，具有較好的處理效果。Yu[15]等將篩選得到的枯草芽孢桿菌和多食鞘氨醇桿菌制備成微生物菌劑用于勝利油田的石油污染修復(fù)，污染土壤經(jīng)過(guò)2個(gè)月的處理，可去除67.7%的石油，具有顯著的修復(fù)效果。

2.1.2 強(qiáng)化土著微生物 相比于外源投加降解菌進(jìn)行污染修復(fù)，強(qiáng)化土著微生物具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，一般能更好地發(fā)揮降解能力，取得更好的降解效果。常用的強(qiáng)化土著微生物措施包括施加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、增加溶氧量等。Fodelianakis[16]等將具有降解能力的菌株加入某煉油廠被污染的土壤中，并與土著微生物的降解效果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源添加的微生物降解效果并無(wú)提高，外源微生物存活率較低，而土著微生物降解效果明顯。Ma[17]等將從煉油廠被污染的土壤中篩選分離出到6種土著高效石油降解菌混合處理污染土壤，經(jīng)過(guò)84 d處理去除率達(dá)63.2%±20.1%，是自然降解的3～4倍。

2.2 生物刺激技術(shù)

為土著菌提供適宜的環(huán)境條件使土著菌能更好地生長(zhǎng)代謝和快速繁殖，從而提高石油烴類(lèi)污染物的降解修復(fù)效率，該技術(shù)被稱(chēng)為生物刺激技術(shù)[11]。在工程上常用的生物刺激措施包括投加表面活性劑、外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。

2.2.1 表面活性劑 石油類(lèi)因?yàn)楹軓?qiáng)的疏水性從而限制微生物與其作用面積，表面活性劑能促進(jìn)石油烴乳化，增加微生物的親油性，增加微生物在油水界面進(jìn)行降解反應(yīng)，提高降解效率。生物表面活性劑比化學(xué)表面活性劑更有優(yōu)勢(shì)，可以被微生物降解，不會(huì)造成二次污染，并且具有好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。曹娟[18]等從石油污染物中篩選到一株降解菌BHSN，經(jīng)研究表明這株菌不但有較高降解能力，而且還能產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，從而避免外加生物表面活性物質(zhì)對(duì)降解菌產(chǎn)生抑制作用。Kaczorek[19]研究了生物表面活性劑鼠李糖脂對(duì)石油烴類(lèi)降解菌假單胞菌降解柴油的影響，結(jié)果表明鼠李糖脂明顯提高了柴油的降解率，14 d后的降解率為88%，而沒(méi)有添加表面活性劑的降解率為54%。Liu[20]等研究了不同濃度的表面活性劑對(duì)熱帶假絲酵母降解十六烷烴的影響，結(jié)果在所有測(cè)試濃度下均可增加其降解率。Wang[21]等用生物表面活性劑處理土著微生物后治理海洋沉積物中石油烴污染，結(jié)果石油烴的降解率為 51.29%，比未經(jīng)處理的菌株降解率提高了17.8%。

2.2.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 雖然石油烴類(lèi)污染給微生物提供了較為充分的碳源，但微生物生長(zhǎng)代謝也需要磷、鐵、氮、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才可順利進(jìn)行。Venosa[22]等對(duì)發(fā)生溢油事故的沙灘進(jìn)行污染修復(fù)，在添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，烷烴生物降解半衰期由原來(lái)的4周變?yōu)?周，石油烴污染物的降解率明顯提高。Oh[23]等研究了施加無(wú)機(jī)緩釋肥對(duì)石油類(lèi)降解菌修復(fù)的影響，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與降解菌的濃度、微生物活性和降解效率有密切的關(guān)系。吳蔓莉[24]等將篩選得到的降解菌與堆肥劑修復(fù)被油污污染的土壤，在低溫環(huán)境中經(jīng)過(guò)處理30 d，總石油烴去除率27%，比自然降解率高得多。

2.3 固定化微生物技術(shù)

固定化微生物技術(shù)指將從自然界中篩選分離得到的或者經(jīng)過(guò)培養(yǎng)馴化的游離微生物，利用物理或者化學(xué)方法將其固定在限定的空間內(nèi)來(lái)增加微生物的密度并保持生物活性，從而提高石油烴類(lèi)污染物降解能力的技術(shù)[25]。固定化微生物技術(shù)可為微生物提供有利環(huán)境，使微生物得到快速繁殖，增加降解菌株的有效濃度。此外，降解微生物產(chǎn)生的胞外酶可以在具有吸附能力的固定化載體上富集，提高降解修復(fù)效率。同時(shí)固定化材料還可以為土著微生物的富集馴化提供場(chǎng)所，使外源微生物與土著微生物可以共同發(fā)揮修復(fù)能力，提高污染物的降解率[26]。該技術(shù)具有反應(yīng)條件易控制、效率高、微生物不易流失等優(yōu)勢(shì)。盧迪[27]將篩選得到的微生物固定化到陶?；钚蕴枯d體上對(duì)加油站石油烴污染土壤進(jìn)行原位修復(fù)，所篩選的菌株在20 d內(nèi)對(duì)石油烴降解率在40%以上。劉虹[28]等將篩選的高效降解石油烴菌株微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌按載體(稻殼木屑硅藻土)比例80%:10%:10%進(jìn)行固定，降解效果最佳可達(dá)75.9%。

姜天翔[29]等利用海洋石油降解菌SI-JHS制成固定化小球治理含油海水，在優(yōu)化條件下石油降解率高達(dá)97.8%，較游離菌提高了22.6%，經(jīng)固定化后的降解菌效率得到顯著提高。Liu[30]等選定海藻酸鈣為固定化材料，經(jīng)包埋處理的降解菌比游離菌降解效率提高1倍，最高降解率可達(dá)78%。劉志秀[31]研究了不同載體固定的石油降解菌的降解效果，對(duì)比發(fā)現(xiàn)柴油降解率從大到小依次為：玉米秸稈>木片>玉米葉>玉米棒>花生殼。其中，以玉米秸稈為載體的固定化菌20 d的柴油降解率為75%。該技術(shù)不僅可以使單位面積可用的微生物數(shù)量得到增加，某些有機(jī)材料還可為微生物生長(zhǎng)提供氮、磷等必需營(yíng)養(yǎng)元素，為微生物生長(zhǎng)代謝與降解創(chuàng)造穩(wěn)定的環(huán)境條件。

2.4 基因工程技術(shù)

雖然目前基因工程菌株應(yīng)用在石油烴污染治理領(lǐng)域較少，但基因工程技術(shù)在石油烴污染治理方面具有很大的開(kāi)發(fā)潛力[32]。在應(yīng)用過(guò)程中，由于石油烴降解菌對(duì)底物具有一定的選擇性，而不同的菌株間有可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而影響修復(fù)效果[33]。針對(duì)以上問(wèn)題，可利用基因工程技術(shù)將針對(duì)不同烴類(lèi)的目的降解基因整合到一個(gè)菌株中，從而實(shí)現(xiàn)重組基因工程菌具有高效降解多種石油烴的能力。Chapracarty等將來(lái)自于假單胞菌屬的4種降解性質(zhì)粒導(dǎo)入到一個(gè)菌株中，該基因重組的工程菌株能同時(shí)降解芳香烴、多環(huán)芳烴和脂肪烴，而且能在幾個(gè)小時(shí)后將自然降解需要一年以上才能降解的浮油去除[34]。2014年，謝云[35]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了一株不動(dòng)桿菌屬轉(zhuǎn)基因工程菌BS3-C230，發(fā)現(xiàn)其具有降解底物廣泛、酶活性較高、穩(wěn)定性較高等優(yōu)勢(shì)，能同時(shí)高效降解石油烴中的烷烴和芳香烴組分。

3 微生物降解石油烴的影響因素

溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、石油烴種類(lèi)等因素，對(duì)微生物降解石油烴類(lèi)污染物影響較大。適宜溫度有利于微生物的生長(zhǎng)代謝，可快速增加降解微生物的濃度并且可以保持較高的降解活性。在一定的范圍內(nèi)隨溫度升高石油烴黏度和溶解度發(fā)生變化，從而增加微生物降解效率[36]。pH可影響細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性，從而影響對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和石油烴降解速率。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物降解影響較大，石油烴污染會(huì)給微生物提供較多碳源，但氮、磷等元素相對(duì)缺乏。因此，氮源和磷源是影響微生物降解效率的限制因素，添加適量營(yíng)養(yǎng)物可以大幅提高生物降解效率。張博凡[37]等探究了不同條件下菌糠炭與固定化菌株蒼白桿菌Q1對(duì)石油烴的降解效果，結(jié)果表明pH值和有機(jī)碳含量對(duì)微生物吸附-降解影響較明顯。在生物降解過(guò)程中氧氣可提供電子供體，保障降解反應(yīng)順利進(jìn)行。在許多石油污染區(qū)，供氧不足往往成為制約降解的關(guān)鍵因素，據(jù)估算每分解1 g石油需氧氣3～4 g[38]。不同種類(lèi)的石油烴其生物可利用性和理化性質(zhì)不同，降解效率不同。一般而言，相同條件下石油烴被微生物降解的難易程度為：直鏈烷烴>支鏈烷烴>環(huán)烷烴>多環(huán)芳烴>雜環(huán)芳烴[39]。

4 展望

雖然在石油烴污染的微生物修復(fù)領(lǐng)域已經(jīng)取得了一些成果，但是仍存在一些問(wèn)題制約其進(jìn)一步發(fā)展。首先，相比于物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)，微生物修復(fù)石油烴污染的周期相對(duì)較長(zhǎng)。微生物生長(zhǎng)代謝需要一定的過(guò)程，另外石油中高分子量的烴類(lèi)、樹(shù)脂和瀝青質(zhì)等降解難度大，相應(yīng)的修復(fù)效率也非常低。因此，篩選或研發(fā)高效的石油降解微生物已成為目前微生物修復(fù)石油烴污染領(lǐng)域的一個(gè)突出熱點(diǎn)。此外，可積極探索微生物修復(fù)與傳統(tǒng)物理或化學(xué)修復(fù)的協(xié)同耦合技術(shù)，發(fā)揮優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，最大程度協(xié)調(diào)優(yōu)化修復(fù)過(guò)程中綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、高效等問(wèn)題。其外，需深入探索混合菌種在降解過(guò)程中相互促進(jìn)或者抑制作用；基于不同微生物生長(zhǎng)代謝的影響因素，優(yōu)化經(jīng)濟(jì)高效的培養(yǎng)與發(fā)酵方法，開(kāi)發(fā)適用性強(qiáng)的高效微生物菌劑，同時(shí)優(yōu)化治理修復(fù)實(shí)施工藝，發(fā)揮最大修復(fù)潛能。此外，在今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)不同學(xué)科交叉研究，積極嘗試新方法，尤其在DNA重組、分子雜交整合技術(shù)、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)接技術(shù)、分子物理與生物工程技術(shù)等方面的基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用。