金倩 范建高

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是遺傳易感和胰島素抵抗引起的代謝功能障礙相關脂肪性肝病，肝臟特征性病變包括大泡性肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細胞氣球樣變以及肝纖維化。隨著肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征的流行，NAFLD已成為全球最常見的慢性肝病，其與肝硬化、肝癌和肝衰竭密切相關[1]。由于NAFLD患者的病理生理機制復雜，涉及肝臟各種類型的細胞與環(huán)境及基質(zhì)效應的相互作用，至今尚缺乏肝細胞脂肪變、脂肪性肝炎和肝纖維化的理想模型。目前廣泛使用的模式動物實驗的主要局限性包括造模時間長、人與動物之間的遺傳學差異、存在實驗動物的倫理問題，以及缺乏人類NAFLD的典型疾病特征[2]。為此，近年來肝病的體外模型特別是肝臟芯片模型已用于NAFLD發(fā)病機制及新藥研發(fā)研究，相關進展迅速。

一、肝病的體外模型

肝臟體外平面模型不能復刻人體肝臟諸多復雜結(jié)構(gòu)，尤其是參與肝纖維化形成的細胞-細胞的相互作用。使用原代人肝臟細胞培養(yǎng)可以有效解決這一問題，但是由于存在異質(zhì)性，該方式的可及性和可重復性有限[3]?，F(xiàn)有的體外模型包括三維(3D)肝球體和生物打印3D模型，但這些模型是靜態(tài)的，缺乏多細胞的相互作用、適當?shù)墓δ苤噩F(xiàn)、可提高模型相關性的原位生物分析能力和動態(tài)線索[4]。為了加強NAFLD的病因及機制研究以及更高通量的藥物篩選以減少肝脂肪變性及其相關炎癥或纖維化反應，亟需建立可重復且精確的仿生體外模型。理想的仿生體外模型需要滿足以下幾點：可復制肝臟的復雜結(jié)構(gòu)及相關細胞的代謝功能、合理的模型生理設計參數(shù)、非特異性吸收和藥物清除、通過相似的機制和試驗終點模擬體內(nèi)對損傷的反應[5]。

肝細胞的二維(2D)培養(yǎng)長期用于疾病模型和藥物開發(fā)，是最簡單的體外肝細胞培養(yǎng)方法，包括肝星狀細胞的平面單培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。在個體發(fā)育過程中，多種發(fā)育信號精確調(diào)控，分化產(chǎn)生功能各異的細胞，并長期穩(wěn)定地維持其生理功能。然而，功能細胞一旦離開體內(nèi)微環(huán)境便會迅速去分化并失去功能。鑒于2D培養(yǎng)無法復制肝小葉內(nèi)動態(tài)理化信號和微環(huán)境結(jié)構(gòu)等自然特征，2D時肝細胞功能通常會迅速喪失，2D研究不適用于肝臟長期研究試驗，并且研究結(jié)果不能簡單類推到人體。當然在某些特殊情況下，微模式共培養(yǎng)物可數(shù)周保持穩(wěn)定并保留某些肝臟特有的功能[3]。但是，這些模型通常在體內(nèi)的基因表達和代謝活性的復制能力有限。

另一種肝臟疾病的體外模型是肝球體，重建類似于天然結(jié)構(gòu)和功能的3D肝組織，包括肝細胞脂肪堆積和膠原沉積。然而，它們通常是靜態(tài)的，并且在多個細胞類型的架構(gòu)和結(jié)合方面受到限制。為了改進這一點，研究人員利用人體細胞開發(fā)了3D模型，包括微流控、微生理平臺，稱為“肝臟芯片”模型[6-7]。

二、肝臟芯片模型

肝臟芯片是一個3D體外肝臟微生理系統(tǒng)，一個微觀模擬肝細胞狀態(tài)和肝臟動態(tài)理化環(huán)境的高通量系統(tǒng)將非實質(zhì)細胞(NPC)整合于由人臍靜脈內(nèi)皮細胞和組織巨噬細胞、庫普弗細胞組成的血管層以及由肝星狀細胞和肝實質(zhì)細胞組成的肝細胞層，二者通過在灌注通道的入口和出口處添加發(fā)光傳感器，實時測量耗氧量[8]。肝臟芯片中的細胞表現(xiàn)出明顯的分化和結(jié)構(gòu)重組，包括極化，但其功能僅穩(wěn)定4 d。另一個巧妙的設計是多尺度結(jié)構(gòu)層次，從而使需要長期培養(yǎng)以觀測藥物清除以及區(qū)域性生理學研究成為可能[9]。然而，由于缺乏對正常肝臟生理至關重要的NPCs，該模型不能充分反映肝細胞功能和極化的生理調(diào)節(jié)。超大肝小葉(VLSLL)芯片模型由一個六角形組織培養(yǎng)室的集成網(wǎng)絡和一個單獨的種子飼喂網(wǎng)絡組成，模擬了肝小葉與中央靜脈的基礎結(jié)構(gòu)[10]。VLSLL芯片擁有膽小管網(wǎng)絡，通過微流控內(nèi)皮樣屏障創(chuàng)建生物激發(fā)的人工肝竇系統(tǒng)。上述兩種模型通過模擬內(nèi)皮層的擴散通道限制肝細胞通過，并保護肝細胞免受壓力，同時允許營養(yǎng)物質(zhì)的擴散。然而，這些非生物內(nèi)皮樣屏障不存在于人體，無法在體內(nèi)重現(xiàn)驗證細胞-細胞相互作用和藥物代謝。

另一種通過恒定灌注以維持3D組織培養(yǎng)的裝置，將多個流體隔離的生物反應器以多孔板的形式集合成一個陣列，每個生物反應器包含一個支架介質(zhì)，從而形成數(shù)以百計的3D微型組織單元[11]，并與連續(xù)的介質(zhì)循環(huán)共同培養(yǎng)的肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞形成功能性肝樣組織。與靜態(tài)多孔板類似，該系統(tǒng)中的生物反應器是流體隔離的，不能結(jié)合兩個或多個單獨的組織培養(yǎng)孔。

三、NAFLD的肝臟芯片模型

油酸(OA)和棕櫚酸(PA)等游離脂肪酸(FFA)可用于誘導原代大鼠肝細胞脂肪變性，其中PA導致劑量依賴性細胞毒性效應與活性氧(ROS)增加和白蛋白生成減少相關。NAFLD芯片設計一個包含人肝癌細胞株(HepG2細胞)的中央腔室，該腔室被緊密間隔的平行微通道包圍，以模擬內(nèi)皮細胞。為了使剪切應力最小，介質(zhì)流經(jīng)一個通過微通道連接到中央腔室的單獨腔室。實驗中，向培養(yǎng)物中添加OA和PA，48 h就可誘導NAFLD，可通過細胞內(nèi)甘油三酯積聚、細胞活力和細胞內(nèi)活性氧水平的測定[12]來揭示發(fā)病機制。

與單細胞培養(yǎng)相比，肝臟芯片模型具有復雜的細胞外基質(zhì)和膽管、緊密連接、橋粒、脂質(zhì)儲存等肝結(jié)構(gòu)，并進一步改善了細胞色素P450(CYP)功能和表達。在另一個基于FFA的NAFLD模型中，使用12個帶有內(nèi)置泵的生物反應器控制產(chǎn)生氧梯度的介質(zhì)的流量來模擬體內(nèi)條件[13]。裝置使用原代人肝細胞，向培養(yǎng)基中添加OA和PA共14 d，細胞內(nèi)出現(xiàn)甘油三酯積聚、CYP2E1和CYP7A1等關鍵基因上調(diào)，并出現(xiàn)炎癥相關蛋白及肝損傷和纖維化。該模型通過顯示肝細胞甘油三酯含量減少，可用于篩選吡格列酮、二甲雙胍等治療脂肪肝的藥物。雖然肝細胞在高濃度的FFA作用下，通過降低CYP3A4等代謝酶活性以及表達多種脂肪因子，從而可以出現(xiàn)脂肪性肝損害。由于缺乏NPC，這種模型仍然缺乏NAFLD的一些特征性改變。

為了研究肝臟與其他器官的相互作用以及藥物動態(tài)反應，目前已研發(fā)成功將不同器官連接在芯片上的多器官平臺。例如，裝置由腸側(cè)膠原支架多孔膜隔開的兩個腔室組成，Caco-2細胞植入腸腔，HepG2細胞植入肝腔[14]。無血清培養(yǎng)基灌流24 h后，再用含OA和PA的培養(yǎng)基灌流細胞24 h，然后對α-脂肪酸(ALA)、丁酸鹽和腫瘤壞死因子(TNF)-α干預后的肝脂肪變進行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALA降低了芯片和2D培養(yǎng)物中甘油三酯積聚；丁酸鹽通過增強腸屏障功能和減少肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚可減輕肝脂肪變性；腫瘤壞死因子-α則通過影響腸道誘發(fā)肝脂肪變性，在2D單層培養(yǎng)中則沒有這種現(xiàn)象。

綜上所述，體外肝細胞培養(yǎng)經(jīng)歷了從經(jīng)典單層培養(yǎng)模式到先進的肝臟器官模型的轉(zhuǎn)變，可更精確地從時間和空間上控制細胞-細胞和細胞-基質(zhì)間相互作用。目前各個商業(yè)公司已開發(fā)了多種用于研究肝病進展、促進藥物研發(fā)及藥物毒性試驗的肝臟芯片模型，分別適用于不同研究目的的肝臟疾病相關試驗，滿足客戶的個性化需求[4]。然而，生物工程技術仍然處于初級起步階段，還需要更多的研究工作來開發(fā)代表性模型用于研究肝脂肪變及其相關肝炎肝纖維化的發(fā)機制和新藥研發(fā)。未來的發(fā)展方向可能集中在包含肝臟所有細胞類型的設備開發(fā)上。此外，對于肝臟模型研究進行實時監(jiān)測而不是終點分析,將更好地了解這些設備中的動態(tài)變化，以便深入探討疾病相關演變過程和發(fā)生機制。隨著技術的不斷改進和完善，肝臟芯片技術有望在基礎生物學研究、制藥業(yè)和臨床肝臟病學領域有十分廣闊的應用前景。