溫仁輝， 柯世業(yè)， 石光耀， 劉定輝， 2， 余顯冠， 凌葉盛， 朱潔明， 錢孝賢， 2△

(中山大學 1附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科， 2中西醫(yī)結(jié)合研究所， 廣東 廣州 510630)

心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的發(fā)病率與死亡率在全球范圍內(nèi)始終居高不下。越來越多的研究表明，除了傳統(tǒng)的心血管疾病危險因素外，定殖于腸道中數(shù)量龐大的微生物菌群及其代謝產(chǎn)物也通過各種復雜的方式在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。研究顯示，氧化三甲胺(trimethylamineN-oxide，TMAO)作為一種重要的腸道菌群代謝產(chǎn)物，與心血管疾病風險之間存在顯著的相關性[2-5]。有研究表明,不同膳食處理的各組小鼠血漿TMAO水平與動脈粥樣硬化斑塊大小存在顯著正相關[2],提示TMAO可能是一種新型的促動脈粥樣硬化的危險因子。然而對于TMAO促動脈粥樣硬化的明確機制目前尚未有定論。

血管內(nèi)皮功能障礙作為動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)，在動脈粥樣硬化發(fā)展的各個階段均起到了關鍵的作用?；钚匝醮?reactive oxygen species, ROS)的過度產(chǎn)生，以及細胞內(nèi)氧化應激的增加是血管內(nèi)皮功能障礙的重要的表現(xiàn)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細胞器，具有極強的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系[7]。當各種理化或生物因素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)或功能損傷時，錯誤折疊蛋白將在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)累積，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。當細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3種跨膜蛋白PERK(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)、ATF6(activating transcription factor 6)和IRE-1(inositol-requiring enzyme 1)與分子伴侶GRP78/BiP(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein)解離，活化并啟動未折疊蛋白質(zhì)反應(unfolded protein response，UPR)，保護由ERS所引起的細胞損傷，恢復細胞功能[8-9]。然而，嚴重或長期持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則將導致細胞進一步的損傷，包括細胞氧化應激的增加和細胞凋亡等[10]。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致的氧化應激增加在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[11]。

為此，本項工作探討TMAO是否誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化應激的增加，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關通路在其中發(fā)揮的作用，以期為闡明TMAO促動脈粥樣硬化的明確機制提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

Ⅰ型膠原酶和M199培養(yǎng)液購自Gibco；內(nèi)皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS)和氧化三甲胺購自Sigma-Aldrich；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自上海吉泰依科賽公司；CCK-8 試劑盒購自Dojindo；細胞裂解液購自上海碧云天；蛋白定量試劑盒(BCA法)和含EDTA的0.5 g/L胰蛋白酶購自南京凱基；ROS測定試劑盒(化學熒光法)購自南京建成；STF-083010購自MedChemExpress；抗phospho-IRE-1α抗體購自Abcam；抗IRE-1α、GRP78/BiP和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；Ⅱ抗購自武漢博士德。

2 方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞提取和培養(yǎng) 原代HUVECs提取及培養(yǎng)參照既往文獻報道[12-13]，簡述如下：健康無菌的新生兒臍帶取自中山大學附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科足月妊娠健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，并立即用于原代HUVECs提取，本研究經(jīng)中山大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，產(chǎn)婦已簽署知情同意書。將提取的原代HUVECs接種于預鋪明膠的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)在含20%FBS的M199培養(yǎng)液中，并置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～3代細胞用于后續(xù)實驗。實驗前換用含5%FBS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，隨即進行后續(xù)實驗。

2.2CCK-8法測定細胞活力 將HUVECs按每孔3×103細胞接種于96孔板中并培養(yǎng)24 h后，按照實驗要求給予不同處理。處理結(jié)束后，于每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度(A)值。細胞相對活力(%)=處理組A/對照組A×100%。

2.3細胞內(nèi)ROS含量的檢測 DCFH-DA是目前常用的細胞內(nèi)ROS檢測探針，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，被胞內(nèi)ROS氧化為強綠色熒光物質(zhì)DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內(nèi)ROS水平。用含EDTA的0.5 g/L胰蛋白酶消化各實驗組的HUVECs，190×g(r=17 cm) 離心5 min收集細胞沉淀，PBS輕輕清洗3次后加入DCFH-DA染色液(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃避光染色30 min，染色結(jié)束后以190×g(r=17 cm) 離心5 min，收集細胞沉渣，PBS輕輕清洗3次，再用500 μL PBS重懸細胞，通過流式細胞術分析染色的細胞。利用FlowJo軟件分析實驗結(jié)果。接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿的HUVECs經(jīng)不同處理后棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕清洗3次，加入DCFH-DA染色液(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃避光染色30 min，染色結(jié)束后PBS輕輕清洗3次，立即用倒置相差熒光顯微鏡觀察并拍攝。

2.4Western blot 將HUVECs接種于6孔板中，貼壁生長至80%時給予不同處理，待處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS輕輕洗2次，每孔加入60 μL細胞裂解液，冰上充分裂解后用蛋白刮刮取細胞蛋白，收集裂解液并于4 ℃超速離心機14 000×g(r=8 cm) 離心15 min后取上清，BCA法測定蛋白含量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入phospho-IRE-1α、IRE-1α、GRP78/BiP及GAPDH(均為1∶1 000)Ⅰ抗4 ℃搖床孵育過夜。棄去Ⅰ抗，TBST洗3次，每次10 min,加入Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，棄去Ⅱ抗，TBST洗3次，每次10 min，用化學發(fā)光法曝光顯影。最后使用ImageJ軟件分析圖像。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度TMAO對HUVECs活力的影響

將HUVECs按每孔3×103細胞接種于96孔板中并培養(yǎng)24 h后，分別予10、30、100和300 μmol/L TMAO作用48 h，或予100 μmol/L TMAO分別作用2、4、8、12、24和48 h。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，各濃度及時間梯度組細胞活力無顯著差異，見圖1。

Figure 1. The effects of trimethylamineN-oxide (TMAO) on viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A: the HUVECs were incubated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (2, 4, 8, 12, 24 and 48 h). Mean±SD.n=3.

圖1 氧化三甲胺對人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響

2 TMAO促進HUVECs氧化應激的增加

用不同濃度(10、30、100和300 μmol/L)的TMAO處理HUVECs 48 h后觀察到，10 μmol/L TMAO作用于HUVECs 48 h即可引起胞內(nèi)DCFH平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)的增加(P<0.05)，并且隨著TMAO濃度增加，MFI也逐漸升高(P<0.05)，見圖2A；用100 μmol/L TMAO分別處理HUVECs 4、12、24和48 h后觀察到，100 μmol/L TMAO處理HUVECs 24 h和48 h均可引起MFI增加(P<0.05)，而4 h組和12 h組MFI與正常對照組相比無顯著差異，見圖2B。

3 TMAO誘導HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生

3.1TMAO對IRE-1α磷酸化水平的影響 用30、100和300 μmol/L TMAO處理HUVECs 48 h均可上調(diào)IRE-1α磷酸化水平(P<0.05);用100 μmol/L TMAO處理HUVECs 12、24和48 h均可上調(diào)IRE-1α磷酸化水平(P<0.05)，其中24 h和48 h組IRE-1α磷酸化水平較正常對照組顯著升高(P<0.01)，見圖3。

3.2TMAO對GRP78/BiP蛋白水平的影響 用30、100和300 μmol/L TMAO處理HUVECs 48 h均可引起GRP78/BiP蛋白水平顯著升高(P<0.05);用100 μmol/L TMAO處理HUVECs 12、24和48 h均可引起GRP78/BiP蛋白水平升高(P<0.05)，其中24 h和48 h組GRP78/BiP蛋白水平較正常對照組顯著升高(P<0.01)，見圖4。

4 STF-083010緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加

用25 μmol/L的IRE1α特異性抑制劑預處理HUVECs 1 h可緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加，TMAO組MFI較control組顯著上升(P<0.05)，而TMAO+STF-083010組MFI較TMAO組下降(P<0.05)，見圖5。

討 論

作為心血管疾病傳統(tǒng)危險因素之一的膳食因素，目前正以腸道菌群這一全新的視角重新獲得廣泛的關注。氧化三甲胺作為一種重要的腸道菌群代謝產(chǎn)物，與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關，但其作用機制仍未有定論。有研究表明，TMAO可通過刺激血小板內(nèi)Ca2+釋放促進血小板聚集，加速血栓形成過程[14]。TMAO可通過快速激活血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞內(nèi)MAPK和NF-κB等信號分子，促進黏附因子的表達[15]。根據(jù)這一系列研究，我們推測TMAO可能通過直接促進動脈粥樣斑塊形成或加重血管內(nèi)皮功能障礙參與到動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展過程中。而在本研究中，盡管TMAO未表現(xiàn)出對HUVECs活力有顯著影響，但是當作用較長時間(>24 h)，較低濃度的TMAO即可引起原代HUVECs氧化應激的增加，提示TMAO有可能通過促進血管內(nèi)皮氧化應激的增加參與到動脈粥樣硬化的病理過程中，且這一作用更趨于長期持續(xù)的刺激引起細胞的慢性反應。

Figure 2. TrimethylamineN-oxide (TMAO) increased ROS level in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the ROS production was detected by flow cytometric analysis; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the ROS production was detected by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 氧化三甲胺促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應激的增加

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是由各種理化及生物因素所引起的，以錯誤折疊蛋白堆積為主要表現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷狀態(tài)，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生時，細胞通過啟動未折疊蛋白質(zhì)反應UPR降低錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能并促進細胞的生存。PERK、ATF6及IRE-1的激活均可介導細胞的促生存信號途徑[16-18]。但是，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過于嚴重或者長期持續(xù)存在時，這3條信號通路的激活同樣可以介導細胞的損傷及凋亡相關信號途徑。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可通過影響細胞內(nèi)Ca2+及Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，進而激活NADPH氧化酶，引起細胞內(nèi)氧化應激的增加[19]。本研究中我們觀察到，TMAO可引起HUVECs IRE-1α磷酸化水平的升高和GRP78/BiP蛋白水平的顯著升高，并且有較為明確的時間或作用濃度節(jié)點，進一步提示TMAO對HUVECs的作用是一個長期慢性的過程。

Figure 3. TMAO increased the phosphorylation level of IRE-1α in HUVECs. A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the phosphorylation level of IRE-1α was detected via Western blot; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the phosphorylation level of IRE-1α was detected via Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖3 氧化三甲胺引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞IRE-1α磷酸化水平升高

Figure 4. TMAO significantly up-regulated the protein level of GRP78/BiP in HUVECs. A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the protein level of GRP78/BiP was detected via Western blot; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the protein level of GRP78/BiP was detected via Western blot. Mean ±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖4 氧化三甲胺引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞GRP78/BiP蛋白水平顯著升高

Figure 5. The inhibitor of IRE1α reduced TMAO-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs. A: the ROS production in HUVECs was observed by phase-contrast microscopy; B: the ROS production in HUVECs was detected by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTMAO group.

圖5 IRE1α抑制劑緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加

在上述實驗基礎上，為了進一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是否參與了TMAO促HUVECs氧化應激的過程，本研究觀察了IRE1α特異性抑制劑STF-083010對TMAO促HUVECs氧化應激的影響。在研究中我們觀察到，STF-083010一定程度上緩解了TMAO促HUVECs氧化應激增加的作用，這為深入闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在TMAO促HUVECs氧化應激中的作用提供了新穎的實驗依據(jù)。值得注意的是，相同條件下，TMAO引起HUVECs IRE-1α磷酸化水平的升高和GRP78/BiP蛋白水平的升高存在不相稱的情況，而后續(xù)實驗IRE1α特異性抑制劑對HUVECs氧化應激的緩解程度同樣存在著一定的限制，二者均提示了PERK和ATF6通路在TMAO促HUVECs氧化應激中可能也起了一定的作用，對3條通路的激活程度及孰占主導有待進一步實驗闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的過程復雜而多樣，值得今后進一步研究。