張立新 段立楠 劉曉麗 焦麗璇 李茜茜 耿艷華 陳 燕

(石家莊醫(yī)學高等?？茖W校中醫(yī)教研室，河北 石家莊 050599)

藥對是以一定證候特點及相應治法為前提，根據藥物的性味歸經、升降沉浮，選擇性地將2味中藥進行配對[1]。藥對是組成中藥復方的基礎，其組成雖簡單，但具備配伍的基本特點，是聯(lián)接單味中藥與復方的橋梁，復方研究常從藥對入手。丹參-黃芪是臨床常用藥對，其中丹參為活血化瘀藥，黃芪為補氣升陽藥，兩藥配伍有益氣活血的功效，常用于冠心病、心絞痛的治療[2]。本研究通過復制急性心肌缺血小鼠模型，觀察丹參-黃芪配伍對其的影響，并對其作用機制進行初步探討，結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠50只，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物許可證號：1103241911029433，體質量(18±2) g，雄性，SPF級。飼養(yǎng)于恒溫恒濕，獨立通氣籠具(IVC)中，滅菌飼料飼養(yǎng)，自由飲用滅菌雙蒸水。

1.1.2 試劑與試藥 丹參、黃芪藥材均購自河北省中醫(yī)院，由主任中藥師鑒定為正品來源。丹參組、黃芪組分別取相應藥材，加水煎煮2次并濃縮成1 g生藥/mL藥液；配伍組為丹參、黃芪藥材等比配伍，合煎并濃縮成1 g生藥/mL藥液。垂體后葉注射液(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，國藥準字H34022977，批號190314)。膠原蛋白酶，美國ROCHE公司；細胞內Ca2+熒光探針Fluo-4 AM，美國Sigma公司；肌球蛋白輕鏈20(myosin light chain 20，MLC20)抗體(貨號ab94730)、磷酸化肌球蛋白輕鏈(Phospho-MLC20，p-MLC20)抗體(貨號ab2480)，美國Abcam公司；蛋白裂解液，上海貝博生物科技有限公司；超敏電致化學發(fā)光(ECL)試劑盒，蘇州新賽美生物科技有限公司；蛋白上樣緩沖液，北京普利萊基因技術有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)，美國Sigma公司。

1.1.3 實驗儀器 激光共聚焦顯微鏡，美國Leica公司；體式顯微鏡，日本Olympus公司；迷你電泳儀，美國Bio-Rad公司；ECL儀，法國Vilber Lourmat公司；Ion Optix單細胞邊緣檢測系統(tǒng)，美國Ion Optix公司；ECG6511心電圖機，廣州艾迪科遜醫(yī)療器械有限公司；HW-400恒溫平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司；迷你電泳槽、042BR-06571電泳儀，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；FR0149多功能成像分析儀，普諾森生物科技(上海)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 分組、給藥及造模 將50只C57BL/6小鼠，隨機分為空白組、模型組、丹參組(20 g生藥/kg體質量)、黃芪組(20 g生藥/kg體質量)和配伍組(丹參、黃芪配伍20 g生藥/kg體質量)，每組10只。丹參組、黃芪組和配伍組分別予相應藥液20 mL/kg體質量灌胃，空白組和模型組予等容積蒸餾水灌胃。給藥1 h后，模型組和各給藥組分別予垂體后葉注射液25 U/kg體質量腹腔注射，空白組予等容積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。

1.2.2 心電圖檢測 末次給藥20 min后，各組小鼠予烏拉坦10 mg/kg體質量腹腔注射麻醉，用心電圖機檢測小鼠心電圖ST段J點上移幅度和心率。

1.2.3 心肌細胞急性分離 將麻醉后的各組小鼠仰面固定，開胸，剪取帶有主動脈的心臟組織，在體式顯微鏡下將周圍血管和脂肪清除干凈，保留主動脈弓。將心臟懸掛于灌流裝置下端，37 ℃恒溫Ⅱ型膠原酶液循環(huán)灌流30 min，待心臟體積增加，質地變軟后取下，剪去動脈、心耳及心房等組織，將剩余的心室組織置于KB液中，撕成碎片。碎片組織用吸管反復吹打為單細胞后，用200目篩網過濾，靜置30 min，備用。

1.2.4 心肌細胞收縮檢測 將分離好的心肌細胞置于1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中孵育10 min，置于顯微鏡下，予10 V、1 Hz的電場刺激，以Ion Optix單細胞邊緣檢測系統(tǒng)檢測并計算心肌細胞肌小節(jié)長度收縮百分率，以評價心肌細胞的收縮舒張功能。

1.2.5 心肌細胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率檢測 配制游離Ca2+熒光探針孵育液，在1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中加入Pluronic F-127和Fluo-4 AM。將急性分離的小鼠心肌細胞室溫孵育游離Ca2+熒光探針30 min。在激光共聚焦顯微鏡下每組隨機選擇細胞，觀測細胞內熒光強度及其變化情況，即心肌細胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率。

1.2.6 心肌細胞MLC20磷酸化水平檢測 取小鼠心肌細胞200 μL，加入蛋白裂解液裂解0.5 mL，用破碎儀勻漿，離心后取上清，并用酶標儀蛋白定量，5×蛋白上樣緩沖溶液，煮沸5 min使蛋白變性，采用Western blotting法檢測心肌細胞中MLC 20磷酸化蛋白和總蛋白表達。取細胞裂解液進行SDS-PAGE凝膠電泳。將電泳后的蛋白25 V恒壓30 min轉至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜，8%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入相應的一抗(1∶1 000)4 ℃過夜。洗膜后，加入稀釋的二抗(1∶10 000)常溫1 h，再次洗膜后進行化學發(fā)光，并掃描、拍照，分析相應蛋白條帶的灰度值，p-MLC20與MLC20灰度值比值即為MLC20磷酸化水平。

2 結 果

2.1 各組小鼠心電圖ST段J點上移幅度和心率比較 見表1。

由表1可見，與空白組相比，模型組小鼠心電圖ST段J點上移幅度顯著增大(P<0.01)，心率顯著加快(P<0.01)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心電圖ST段J點上移幅度均顯著減小(P<0.01)，心率減慢(P<0.01，P<0.05)。與配伍組相比，丹參組心電圖ST段J點上移幅度增大(P<0.05)，心率無明顯變化(P>0.05)；黃芪組心電圖ST段J點上移幅度顯著增大(P<0.01)，心率加快(P<0.05)。

表1 各組小鼠心電圖ST段J點上移幅度和心率比較

2.2 各組小鼠心肌細胞肌小節(jié)長度收縮百分率比較 見表2。

表2 各組小鼠心肌細胞肌小節(jié)長度收縮百分率比較

由表2可見，與空白組相比，模型組小鼠肌小節(jié)長度收縮百分率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，丹參組、配伍組小鼠肌小節(jié)長度收縮百分率降低(P<0.05，P<0.01)，黃芪組雖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但也有降低趨勢。配伍組小鼠肌小節(jié)長度收縮百分率與丹參組、黃芪組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但也有降低趨勢。

2.3 各組小鼠心肌細胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率比較 見表3。

表3 各組小鼠心肌細胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率比較

由表3可見，與空白組相比，模型組小鼠心肌細胞鈣瞬變幅度明顯增大(P<0.05)，鈣回收速率明顯加快(P<0.05)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心肌細胞鈣瞬變幅度均明顯降低(P<0.05)；丹參組和配伍組鈣回收速率均明顯減慢(P<0.05)，黃芪組雖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但也有減慢趨勢。配伍組小鼠心肌細胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率與丹參組、黃芪組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但有減小趨勢。

2.4 各組小鼠心肌細胞MLC20磷酸化水平比較 見圖1，表4。

圖1 各組小鼠心肌細胞MLC 20磷酸化水平比較

表4 各組小鼠心肌細胞MLC 20磷酸化水平比較

由圖1、表4可見，與空白組相比，模型組小鼠心肌細胞中MLC20的磷酸化水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心肌細胞MLC20磷酸化水平均顯著降低(P<0.01)。配伍組小鼠心肌細胞MLC20磷酸化水平顯著低于丹參組和黃芪組(P<0.01)。

3 討 論

急性心肌缺血是由多種原因引起的心肌相對或絕對供血不足，心肌細胞缺氧，臨床表現(xiàn)為急性心肌梗死、突發(fā)心絞痛，可危及患者生命[3]。急性心肌缺血屬中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇，基本病機為氣滯血瘀，多以活血化瘀、益氣活血為法治療[4]。張仲景《傷寒雜病論》云“干血不去，則足以留新血而灌溉不周”。氣為血之帥，血為氣之母，血液在脈中循行有賴于心氣的鼓動，故而在治療血瘀證時多以活血藥和補氣藥配伍[2]。本研究項目組通過對近年的臨床文獻進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，丹參-黃芪是治療冠心病心絞痛使用頻率最高的藥對之一[5-6]。丹參味苦性微寒，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神的功效，為活血化瘀的要藥。黃芪味甘性微溫，具有補氣升陽、行滯通痹、利水消腫的功效，為升陽補氣之圣藥。兩藥等比配伍，益氣活血之功力宏，常用于冠心病、心絞痛的治療，臨床上治療此類疾病的芪參益氣滴丸、芪參膠囊均為丹參-黃芪的配伍[7-8]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪抑制心肌收縮、缺血時心臟保護的作用皆與鈣拮抗有關[9-10]。因此，本研究對丹參-黃芪配伍抗急性心肌缺血的作用進行評價，并從鈣調控、抑制心肌細胞收縮的角度對兩藥配伍抗心肌缺血的作用機制進行探討。

垂體后葉素能夠作用于加壓素受體，引起冠狀動脈痙攣，導致心肌供血不足和心肌損傷，全身小血管收縮，造成心臟后負荷加重，引起心肌缺血[3]。本研究連續(xù)7 d給小鼠腹腔注射垂體后葉可復制急性心肌缺血模型。模型組小鼠心電圖表現(xiàn)出明顯的ST段J點抬高，心率加快(P<0.05)。予丹參、黃芪及兩藥配伍水煎液干預后，小鼠心電圖ST段J點降低，心率減慢，且兩藥配伍的效果優(yōu)于單獨使用。

本研究還從心肌細胞收縮和鈣調控角度對丹參-黃芪配伍抗急性心肌缺血的作用機制進行初步的研究。研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪和兩藥配伍干預均能顯著降低小鼠心肌細胞收縮力，表現(xiàn)為肌小節(jié)長度收縮百分率降低(P<0.05)?，F(xiàn)代生理學研究顯示，心肌細胞漿內Ca2+濃度的變化與細胞收縮密切相關。心肌興奮時，細胞外Ca2+通過L型鈣通道進入胞漿，并觸發(fā)肌漿網內鈣釋放，使胞漿中Ca2+濃度迅速上升[11]。繼而，Ca2+又被鈣泵泵回肌漿網或排出細胞，使胞漿內Ca2+濃度降低。胞漿內Ca2+濃度升高能夠與鈣調蛋白(calmodulin，CaM)形成復合體，通過激活肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)使MLC20發(fā)生磷酸化，引發(fā)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，導致心肌收縮[12]?？梢?，心肌細胞漿內的Ca2+濃度與細胞收縮程度有關，Ca2+濃度變化速率與細胞收縮頻率有關。因此，本研究以鈣瞬變幅度和鈣回收速率評價心肌細胞漿內Ca2+濃度的變化情況。其中，鈣瞬變幅度用F/F0(即鈣瞬變曲線的峰值與基線的比值)表示，比值越大說明鈣瞬變幅度越大，心肌細胞漿內的Ca2+最高濃度越大；心肌細胞鈣回收速率則與鈣回收的速度有關，該值越大，表明鈣回收速率越慢[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪和兩藥配伍均可降低鈣瞬變幅度，減慢鈣回收速率，使MLC20的磷酸化程度降低，且兩藥配伍效果更好。進一步證實丹參、黃芪有鈣拮抗作用，且兩藥能夠協(xié)同生效。

綜上所述，丹參、黃芪均對小鼠實驗性急性心肌缺血有較好的改善作用，且兩藥配伍應用的效果更好。其機制與降低鈣瞬變幅度，減慢鈣回收速率，降低MLC20的磷酸化程度，從而抑制心肌細胞收縮，減慢心率有關。