唐振寧，李璐，張朝林，劉奇?zhèn)?/p>

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外三科，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004

甲狀腺癌的發(fā)病率近年來在我國逐漸增加[1]，其中乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%。除了原發(fā)瘤發(fā)病率明顯增加外，甲狀腺乳頭狀癌的局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率同樣呈增加的趨勢，因此研究甲狀腺乳頭狀癌的病理學(xué)行為，才能對甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)行更加精準(zhǔn)的預(yù)防和治療[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)通常是指細(xì)胞通過分子及細(xì)胞改變，使得細(xì)胞的黏附能力、極性以及上皮標(biāo)記物的表達(dá)水平下降，從而獲得了細(xì)胞的活動性、梭形性以及間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)記。目前多數(shù)研究認(rèn)為EMT 過程能夠使得腫瘤細(xì)胞從瘤體脫落而發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，與此同時(shí)EMT 同樣參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對于治療的耐受過程[4]。EMT在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中同樣起關(guān)鍵作用，但目前對甲狀腺乳頭狀癌EMT的分子標(biāo)記物及具體機(jī)制仍存在爭議[5]。本文擬檢測EMT的關(guān)鍵標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月1日至12月31日在寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院住院治療，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的甲狀腺乳頭狀癌患者標(biāo)本63份，其中獲取癌旁組織標(biāo)本36份，另取結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者標(biāo)本23份。甲狀腺癌患者年齡19~80歲，中位年齡47.5 歲；男性18例，女性45例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，其中單純Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。根據(jù)2002美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)甲狀腺癌TNM分期，Ⅰ期41例，Ⅱ期1例，Ⅲ期11例，Ⅳa期10例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 E-cadherin (ZA0565)、Vimentin(ZA0511)兔抗人多克隆抗體購自中杉金橋公司，二抗及DAB試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 免疫組織化學(xué)使用染色鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶法(streptavidin-perosidase，SP法)。常規(guī)取材腫瘤組織、癌旁組織(距離腫瘤組織2 cm)。E-cadherin、Vimentin一抗的工作濃度為1∶100，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒視為陽性表達(dá)，結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比綜合判定。染色強(qiáng)度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占百分比<5%為0 分，5~25%為1 分，26%~50%為2 分，51%~75%為3 分，>75%為4 分。兩者乘積0~3分為陰性(-)，4~6分為弱陽性(+)，7~9分為中等強(qiáng)度陽性(++)，10~12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin 在不同類型甲狀腺組織中的表達(dá) E-cadherin 陽性染色部位為細(xì)胞膜，胞膜呈連續(xù)棕黃色、棕褐色線性分布，見圖1。63例甲狀腺乳頭狀癌組織中E-cadherin 表達(dá)陽性45 例(71.43%)；36 例癌旁組織中E-cadherin表達(dá)陽性7例(19.44%)；23例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中E-cadherin表達(dá)陽性4例(17.39%)，甲狀腺乳頭狀癌E-cadherin 蛋白表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁組織E-cadherin蛋白表達(dá)與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甲狀腺乳頭狀癌E-cadherin 蛋白表達(dá)高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 E-cadherin在不同甲狀腺組織中的陽性率比較(例)

圖1 E-cadherin 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)(×100，箭頭所指為陽性細(xì)胞)

2.2 Vimentin 在不同類型甲狀腺組織中的表達(dá) Vimentin陽性染色部位為細(xì)胞漿，呈棕黃色、棕褐色巢團(tuán)狀或片狀分布的顆粒，見圖2。Vimentin 在63例甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)陽性53例(84.13%)，36例癌旁組織中Vimentin表達(dá)陽性27例(75.00%)；23例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中E-cadherin 表達(dá)陽性17 例(73.91%)，三組Vimentin陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.702，P=0.704)，見表2。

圖2 Vimentin在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)(×100，箭頭所指為陽性細(xì)胞)

表2 Vimentin在不同甲狀腺組織中陽性率比較

2.3 不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者E-cadherin、Vimentin 表達(dá)陽性率比較 不同年齡、不同腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌患者E-cadherin、Vimentin陽性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者E-cadherin、Vimentin陽性率比較

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病近幾十年間在世界范圍內(nèi)明顯增加，其中甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率的增加在各種類型中最為顯著[6]。雖然甲狀腺乳頭狀癌與其他類型的甲狀腺癌相比，具有發(fā)展慢、療效好和預(yù)后好的特點(diǎn)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移仍然是影響甲狀腺乳頭狀癌患者生存及生活質(zhì)量的主要因素，有報(bào)道顯示約有15%甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者伴有局部侵犯并對傳統(tǒng)治療耐受[7-9]。目前術(shù)前可以通過超聲或增強(qiáng)CT 來評估甲狀癌患者的頸部淋巴結(jié)情況，但這些手段的靈敏度僅有23%~67%[9]。傳統(tǒng)的甲狀腺乳頭狀癌治療方式包括：手術(shù)、甲狀腺激素治療以及核醫(yī)學(xué)治療，上述的治療方式對人體都具有一定的副作用。因此了解甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移機(jī)制，進(jìn)而對探索甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)防及治療新手段有著重要的意義。

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞能夠通過EMT,改變其細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而獲得移動和侵襲特性，促使腫瘤細(xì)胞由原發(fā)癌遷移播散[10]。EMT 的作用已在多數(shù)實(shí)體腫瘤的演進(jìn)中得到證實(shí)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥以及腫瘤干細(xì)胞的形成有著密切關(guān)系[11-12]。由于甲狀腺乳頭狀癌生物學(xué)行為具有特殊性，EMT在甲狀腺乳頭狀癌的作用及機(jī)制目前仍存在爭議[13]。進(jìn)一步了解EMT在甲狀腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中作用和機(jī)制，通過抑制這一轉(zhuǎn)化過程，達(dá)到防治的目的，不失為甲狀腺癌防治的新策略。

目前的研究主要通過上皮或間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)的改變來確定EMT 發(fā)生，上皮特性的標(biāo)記物包括Ecadherin，閉鎖蛋白(occludins)等，vimentin、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)則是間質(zhì)特性的標(biāo)記物[10]。本研究選取常見的標(biāo)志性標(biāo)記分子E-cadherin 和vimentin 作為研究對象，探討兩者在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及意義。鈣粘蛋白是一個(gè)鈣相關(guān)的細(xì)胞黏附糖蛋白，是由鈣粘 蛋白1 基 因 編 碼，E-cadherin 通 過β-catenin 和α-catenin 通路調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架[14]。E-cadherin 的表達(dá)和下調(diào)通常是由遺傳、體細(xì)胞突變、啟動子的甲基化以及一些轉(zhuǎn)錄因子的抑制造成的[15]。EMT 過程中，Ecadherin 的表達(dá)通常會表現(xiàn)降低。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中的E-cadherin陽性表達(dá)率高于癌旁組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，與國外研究結(jié)果一致[16]。研究顯示E-cadherin 表達(dá)缺失，會增加甲狀腺癌局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[17]，E-cadherin的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，與患者的性別、年齡及腫瘤的大小無關(guān)[18]。ZHOU 等[19]近期對46 項(xiàng)研究進(jìn)行meta 分析顯示：E-cadherin 的表達(dá)和甲狀腺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及TNM 分期相關(guān)。而SETHI等[16]研究則發(fā)現(xiàn)，E-cadherin的表達(dá)與甲狀腺癌包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移無關(guān)。本研究結(jié)果表明甲狀腺癌乳頭狀癌患者E-cadherin的表達(dá)與發(fā)病年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。MITCHELL等[2]研究同樣發(fā)現(xiàn)，E-cadherin的表達(dá)與腫瘤大小、腺體外侵犯等預(yù)后相關(guān)因子均無關(guān)，認(rèn)為甲狀腺乳頭狀癌EMT并不通過缺失E-cadherin而發(fā)生，其發(fā)生機(jī)制可能與其他腫瘤不同。也有研究表明E-cadherin可能與甲狀腺癌的分化程度有關(guān)，分化型甲狀腺癌向未分化型甲狀腺癌轉(zhuǎn)化的過程中，E-cadherin蛋白的表達(dá)逐步減少[15]。

在EMT 過程中，細(xì)胞骨架蛋白通過重組，使得細(xì)胞與間質(zhì)充分接觸，增加細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離并發(fā)生遷移和侵襲的能力。vimentin是細(xì)胞骨架蛋白中一個(gè)重要成員，是EMT的重要因子。一些細(xì)胞學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)vimentin 參與了甲狀腺癌EMT 過程[4]，也有文獻(xiàn)報(bào)道甲狀腺乳頭狀癌vimentin 的表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，vimentin的表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌、癌旁組織以及結(jié)節(jié)性甲狀腺組織中無顯著性差異，與甲狀腺良惡性病變與否無關(guān)。同時(shí)本研究結(jié)果表明，vimentin 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的大小、患者年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與CALANGIU等[21]的研究結(jié)果相符。因此vimentin表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的意義仍然需要進(jìn)一步研究。也有學(xué)者報(bào)道，經(jīng)典和濾泡型甲狀腺乳頭狀癌的vimentin表達(dá)水平高于高細(xì)胞型乳頭狀癌[21]，提示今后的研究需要考慮甲狀腺乳頭狀癌的組織學(xué)亞型因素。

綜上所述，E-cadherin 可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的形成過程。本研究中未發(fā)現(xiàn)vimentin在甲狀腺乳頭狀癌和良性病變的差異，研究結(jié)果未提示E-cadherin、vimentin表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的大小、患者年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，今后需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，或采用其他研究方法進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。