溫奇龍，銀喆，羅育，蔡丹昭

1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021；

2.廣西醫(yī)科大學(xué)廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021

扶芳藤為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠藤本灌木，具有行氣活血、止血化瘀、治腰肌勞損、關(guān)節(jié)酸痛、月經(jīng)不調(diào)及創(chuàng)傷出血等功效[1]。黃酮類(lèi)、三萜、兒茶素類(lèi)、多糖為扶芳藤主要成分[2-4]，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)于扶芳藤總?cè)频南嚓P(guān)研究比較少。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體許多重要的生物大分子—核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等易被具有強(qiáng)氧化反應(yīng)能力的自由基氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體損傷，且不可逆轉(zhuǎn)[5]。在細(xì)胞衰老過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)抗氧化能力隨機(jī)體活性氧自由基的升高而減弱，線粒體、脂肪酸受外界環(huán)境刺激可產(chǎn)生過(guò)氧化氫、超氧陰離子等各種過(guò)氧化因子，觸發(fā)過(guò)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，引起細(xì)胞凋亡，加速衰老進(jìn)程[6]。2017年9月至2018年4月，本研究觀察了扶芳藤總?cè)茖?duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清及各組織中總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化指標(biāo)的影響，為探討其抗氧化作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雄性昆明小鼠75只，體質(zhì)量20~23 g，周齡6~7周，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK-桂2014-0002)。(2)主要試劑：扶芳藤總?cè)朴杀緦?shí)驗(yàn)室取莖葉制備，純度≥64.5%，所用扶芳藤原料購(gòu)自廣西中醫(yī)藥公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授定為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物扶芳藤。過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)檢測(cè)試劑盒、總抗氧化(T-AOC)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，D-半乳糖(0.2 mg/mL，純度＞99%)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，黃芪多糖(純度≥50%)購(gòu)于西安錦鴻生物科技有限公司，其他試劑均為市售分析純。(3)主要儀器：美國(guó)BioTek公司EPOCH2型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，德國(guó)Hettich公司Mikro220R型離心機(jī)。

1.2 建模及分組處理 選擇雄性昆明小鼠75只，室溫(26±1)℃、晝夜各12 h、常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將小鼠按單純隨機(jī)抽樣法分為對(duì)照組、模型組、扶芳藤總?cè)聘?、低劑量組及黃芪多糖組，每組15 只。除對(duì)照組外其余4 組均建立衰老模型，即按照小鼠重量于頸背部皮下注射D-半乳糖溶液0.25 mL/10 g，對(duì)照組注射等量生理鹽水，連續(xù)14 d。配制扶芳藤總?cè)聘?、低劑量溶液及黃芪多糖溶液，濃度分別為2.1 mg/mL、1.7 mg/mL、8.0 mg/mL。建模第15 天，扶芳藤總?cè)聘摺⒌蛣┝拷M及黃芪多糖組按體質(zhì)量分別給予扶芳藤總?cè)聘?、低劑量溶液及黃芪多糖溶液0.25 mL/10 g灌胃，模型組和對(duì)照組均給予等量純水灌胃，連續(xù)35 d。

1.3 血清T-AOC、GSH-Px水平檢測(cè) 采用灌胃給藥第49天，經(jīng)75%乙醇消毒后，摘取眼球。收集眼球血1 mL于離心管中，室溫條件放置20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?T-AOC、GSH-Px 活性均采用酶法檢測(cè)，并嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 心臟、肝臟、骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 表達(dá)檢測(cè) 各組摘取眼球后采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取心臟、肝臟、腓腸肌處骨骼肌組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗2 次，濾紙拭干。將組織剪碎后，加入預(yù)冷的生理鹽水，冰上制成10%組織勻漿。2 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃保存待用。 T-AOC、CAT、GSH-Px 活性采用酶法檢測(cè),并嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定，以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照為蒸餾水，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程y=2.039 7x－0.000 8，R2=0.996 2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中T-AOC、GSH-Px 水平比較 由表1可知，與對(duì)照組比較，低劑量組及黃芪多糖組血清中的T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組及黃芪多糖組血清中的T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組血清中的T-AOC 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組血清中的GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃芪多糖組血清中的GSH-Px水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組血清中的GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組血清中的GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高、低劑量組血清中T-AOC、GSH-Px水平整體低于黃芪多糖組，其中低劑量組血清中T-AOC、GSH-Px水平整體高于扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M。

images/BZ_13_207_686_1207_719.png組別對(duì)照組模型組扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mL)7.82±2.51 3.78±0.82 13.94±5.17ab 8.38±1.92 15.61±8.58abd 8.019<0.01 GSH-Px(U/mL)46.52±23.27 12.75±5.19a 81.66±37.09b 49.28±39.59b 87.59±40.90abc 7.738<0.01注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M比較，cP<0.05；與扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M比較，dP<0.05。

2.2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平比較 由表2 可知，與對(duì)照組比較，模型組心臟組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高、低劑量組心臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組心臟組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組心臟組織中CAT 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組及黃芪多糖組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，黃芪多糖組及高劑量組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組心臟組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 整體水平高于黃芪多糖組及低劑量組。

表2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較)

表2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M比較，cP<0.05；與扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M比較，dP<0.05。

組別對(duì)照組模型組扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)48.43±11.68 31.41±6.14a 66.21±12.93ab 69.14±11.59ab 55.59±18.44bd 10.642<0.01 CAT(U/mg)57.82±23.28 38.80±14.32a 57.87±17.03b 86.93±19.55abc 78.98±16.69abc 7.695<0.01 GSH-Px(U/mg)619.40±297.65 258.14±78.54a 1 025.37±606.30b 1 007.55±641.67b 801.11±350.91b 4.956<0.01

2.3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較 由表3可知，與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織中T-AOC水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織中CAT 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組肝臟組織中CAT 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中CAT水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組肝臟組織中CAT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織中GSH-Px水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量組肝臟組織中GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組肝臟組織中GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組肝臟組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平整體高于黃芪多糖組及低劑量組。

表3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較

表3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較

組別對(duì)照組模型組扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)48.89±16.63 31.25±8.95a 53.12±15.01b 58.51±13.59b 53.88±19.28b 4.361<0.01 CAT(U/mg)377.27±15.52 314.25±17.23a 407.93±22.78b 427.13±35.56ab 385.29±26.82bd 25.050<0.01 GSH-Px(U/mg)2 864.08±348.37 2 214.16±187.25a 3 153.94±559.59b 3 682.64±571.14abc 3 159.91±453.22bd 11.660<0.01images/BZ_13_207_3244_2086_3278.png

2.4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較 由表4可知，與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌組織中CAT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組骨骼肌組織中CAT水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中CAT水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃芪多糖組及高劑量組骨骼肌組織中GSH-Px水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中GSH-Px水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組骨骼肌組織中T-AOC、CAT水平高于黃芪多糖組及低劑量組，高、低劑量組骨骼肌組織中GSH-Px水平均低于黃芪多糖組。

表4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較(

表4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較(

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M比較，cP<0.05；與扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M比較，dP<0.05。

組別對(duì)照組模型組扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)16.56±4.57 12.58±3.58a 21.49±5.82ab 22.66±6.97ab 21.31±5.31ab 5.805<0.01 CAT(U/mg)60.94±16.50 44.41±14.50a 81.24±24.46b 89.73±37.31ab 67.92±36.09b 3.248<0.05 GSH-Px(U/mg)1 481.86±420.03 1 157.51±308.14a 1 814.51±343.82b 1 854.44±302.47ab 1 940.30±919.66ab 2.637<0.05

3 討論

三萜類(lèi)化合物是一類(lèi)具有抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗炎等多種功效的重要天然抗氧化活性物質(zhì)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，大量自由基可損傷DNA 和生物膜，破壞免疫系統(tǒng)功能，與腎結(jié)石、白血病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[10-12]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖劑量增加可使脾脂褐素顆粒的凝聚力與分布減少，且黃芪多糖不僅可抑制與衰老相關(guān)的β-半乳糖甘酶(SAβ-gal)表達(dá)，還可降低SAβ-gal的活性[13-15]。因此，本研究選擇黃芪多糖作為抗衰老藥物的對(duì)照。

研究表明，生物在其生理過(guò)程中產(chǎn)生的氧化自由基與疾病的產(chǎn)生及生物病變有著最直接的關(guān)系[16]。機(jī)體對(duì)自由基的清除能力可通過(guò)抗氧化指標(biāo)T-AOC、CAT 及GSH-Px 體現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外自由基的清除反應(yīng)及機(jī)體體內(nèi)抗氧化劑之間的相互協(xié)作可通過(guò)T-AOC 的強(qiáng)弱反映，且機(jī)體的健康、衰老及疾病等也可通過(guò)T-AOC的強(qiáng)弱反映，因此T-AOC是衡量生物機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的最優(yōu)指標(biāo)之一[17-18]，陳鷺?lè)f等[19]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、原發(fā)性及腎性高血壓患者檢測(cè)血漿中T-AOC 水平均低于健康組。CAT 是一種存在于紅細(xì)胞及某些組織細(xì)胞的微粒體中的酶，其成分鐵卟啉可使超氧化物歧化酶催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，繼而使過(guò)氧化氫分解成水和氧分子，使機(jī)體免受自由基損傷[20]，李彬先等[21]研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎患者血清中CAT升高程度與患者的病情呈平行關(guān)系。在機(jī)體的抗脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，GSH-Px 可阻止機(jī)體內(nèi)自由基引起的膜脂質(zhì)過(guò)氧化，清除丙二醛(MDA)及多種過(guò)氧化產(chǎn)物，并分解過(guò)氧化氫，GSH-Px是重要的過(guò)氧化物分解酶[22]。白桂芹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞被乙型、丙型肝炎病毒感染后，硒蛋白GSH-Px表達(dá)改變，并與硒結(jié)合蛋白相互作用，使脂質(zhì)過(guò)氧化作用被干擾，引起病毒性肝炎。

通過(guò)皮下注射D-半乳糖，小鼠細(xì)胞代謝紊亂[24]，不僅導(dǎo)致肝、腦、脾臟和胸腺等器官衰退[25-26]，還引發(fā)血液、心肌和骨骼肌等組織的病理改變[27-28]，這一過(guò)程與機(jī)體的自然衰老過(guò)程相似，因此可通過(guò)檢測(cè)衰老模型小鼠血清、心臟、肝臟及骨骼肌等組織抗氧化指標(biāo)的變化進(jìn)行抗衰老研究。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組T-AOC、CAT、GSH-Px 水平比較，除小鼠血清模型組T-AOC水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，小鼠血清模型組GSH-Px水平及小鼠心臟、肝臟、骨骼肌組織模型組T-AOC、CAT、GSH-Px 水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明建模成功。該模型結(jié)果穩(wěn)定，具有價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單易行和成模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是衰老研究中常用的一種動(dòng)物模型[29]。本研究中血清CAT 數(shù)值誤差偏大，因操作中時(shí)間誤差及室內(nèi)溫度變化引起，后經(jīng)討論決定舍棄。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扶芳藤總?cè)瓶缮咚ダ闲∈髾C(jī)體的T-AOC、CAT、GSH-Px 水平，其中扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M血清中T-AOC、GSH-Px 水平高于扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M，而扶芳藤總?cè)聘邉┝拷M心臟、肝臟、骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平整體又高于扶芳藤總?cè)频蛣┝拷M，經(jīng)討論分析出現(xiàn)該現(xiàn)象與扶芳藤總?cè)萍兌容^低、其他成分影響及扶芳藤總?cè)圃谘搴筒煌M織中的量效關(guān)系不同有關(guān)。

綜上所述，扶芳藤總?cè)瓶商岣咚ダ闲∈竽Ｐ偷腡-AOC、CAT、GSH-Px水平，從而增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗氧化能力。本研究可為扶芳藤資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。