許小凡，楊娟，來裕婷，周磊，石硌，王沖，張紅，，段麗芳

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，陜西 咸陽 712046；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；

3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046

結(jié)腸癌是世界排名第三的消化道惡性腫瘤，每年導(dǎo)致約70 萬人死亡[1]。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。結(jié)腸癌的病理過程包括結(jié)腸黏膜細(xì)胞的基因突變、黏膜增生、腺瘤的形成及癌變的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等。研究發(fā)現(xiàn)，飲食習(xí)慣與結(jié)腸癌的發(fā)生存在一定的關(guān)系，尤其是高脂肪和低纖維素飲食與結(jié)腸癌的發(fā)病高度相關(guān)[2]。高脂飲食易引發(fā)肥胖，而肥胖時機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)被認(rèn)為在肥胖與癌癥的關(guān)系中發(fā)揮重要作用，可通過影響癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡最終導(dǎo)致癌變的發(fā)生[3]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)可發(fā)生于特定的生理或者病理狀態(tài)，是指上皮細(xì)胞失去極性，向位于細(xì)胞基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中均可見EMT 的參與，已有的研究證實(shí)了細(xì)胞在發(fā)生EMT 后侵襲力及運(yùn)動能力增強(qiáng)，這一特性使得癌細(xì)胞更易于轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。

肥胖易導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生率增加，而EMT與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著緊密聯(lián)系，那么，EMT 是否與肥胖相關(guān)性結(jié)腸癌的炎-癌演變進(jìn)程有關(guān)，目前尚不清楚。本研究擬通過高脂飼喂誘導(dǎo)小鼠肥胖，再采用促炎和基因毒性造模劑復(fù)制小鼠結(jié)腸炎-癌演進(jìn)模型，通過觀察其結(jié)腸組織病理改變、炎癥因子及EMT標(biāo)志物的表達(dá)改變，闡明EMT在肥胖相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠(雌) 30 只，6~8 周齡[(20±2)g]，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 試劑與儀器 氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AMO)購自Sigma 公司，葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)購自MP Biomedicals公司，蘇木精及伊紅試劑購自索萊寶公司，TNF-α、E-cadherin、N-cadherin抗體及抗羊、抗兔SABC試劑盒均購自博奧森生物公司，顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(日本奧林巴斯BX53)，其他試劑購于當(dāng)?shù)厣锕咎峁┑淖罡呒兌然瘜W(xué)試劑。

1.2 方法

1.2.1 高脂飼料制作 小鼠高脂飼料中各成分比例為普通飼料70%、豬油10%、蛋黃10%、奶粉10%、膽固醇0.025%。

1.2.2 動物模型建立 昆明小鼠置于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)(20±2)℃，經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后先隨機(jī)分為兩組，即普通飼喂組組和高脂飼喂組，每組15 例。飼喂期間，普通飼喂組予普通小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，高脂飼喂組采用高脂飼料喂養(yǎng)。所有小鼠均自由飲食飲水，每天更換飼料和飲水，每周稱量并記錄體重，8周后挑選出高脂飼喂組中體重超過普通組小鼠體重的20%的小鼠，即為高脂肥胖小鼠(n=24)。隨后將小鼠分為三組：①空白對照組(n=6)；②普通飼喂模型組(n=8)，以上兩組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)；③高脂模型組(n=10)，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。將普通飼喂模型組及高脂模型組小鼠采用1 mg/mL AMO一次性腹腔注射(空白對照組小鼠予同等劑量生理鹽水腹腔注射)，1周后開始予2.5%DSS代替飲水一周，正常飲水兩周，依次循環(huán)至10周(空白對照組小鼠自由飲水)。

1.2.3 小鼠取材 在盲、結(jié)腸交界和骨盆處分離出全結(jié)腸，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗腸道，縱向剖開，觀察結(jié)腸中形成的腫瘤個數(shù)及大小。留取小鼠的結(jié)腸組織，經(jīng)4%甲醛溶液固定12 h 后以備后續(xù)組織脫水、包埋、切片用。

1.2.4 結(jié)腸組織的病理學(xué)觀察 小鼠結(jié)腸組織常規(guī)脫水包埋后，制作3 μm石蠟切片。根據(jù)試劑盒說明采用蘇木精—伊紅染色法觀察各組小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 小鼠結(jié)腸組織3 μm石蠟切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液加熱15 min，室溫冷卻后經(jīng)PBS 洗5 min×3 次，3% H2O2室溫孵育10 min，正常山羊血清封閉液室溫孵育1 h；TNF-α一抗、E-cadherin 一抗、N-cadherin 一抗(均1∶200)4℃過夜，即用型生物素化羊抗兔二抗37℃孵育1 h；SABC 經(jīng)37℃孵育30 min；DAB 顯色、復(fù)染、鏡驗(yàn)、脫水、封片，采用奧林巴斯顯微鏡BX53 觀察并進(jìn)行圖像采集。每張切片在40 倍物鏡下選取4 個視野計數(shù)陽性細(xì)胞的個數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織病理學(xué)改變 高脂模型組小鼠可見腸上皮細(xì)胞排列紊亂，杯狀細(xì)胞消失，并可觀察到類似上皮內(nèi)瘤變的病理改變，而普飼模型組小鼠結(jié)腸黏膜層及黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤，但上皮內(nèi)瘤變明顯少于高脂模型組，見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變(HE染色，100×)

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α的表達(dá)變化 與空白對照組比較，普飼模型組和高脂模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α陽染細(xì)胞均明顯增加，且高脂模型組小鼠結(jié)腸TNF-α陽染細(xì)胞數(shù)較普飼模型組顯著增加，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=128.2，P<0.01)，見圖2和表1。

表1 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α陽性染色細(xì)胞數(shù)比較(個/視野)

表1 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α陽性染色細(xì)胞數(shù)比較(個/視野)

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與高脂模型組比較，bP<0.01。

組別空白對照組普飼模型組高脂模型組只數(shù)5 5 5 TNF-α陽性染色細(xì)胞數(shù)1.333±0.492 15.60±2.261a 25.82±6.353ab

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α的表達(dá)變化(IHC，200×)

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織E-Cadherin，N-Cadherin的表達(dá)變化 高脂模型組小鼠由于大量的腸上皮細(xì)胞破壞，結(jié)腸上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)注物N-cadherin 表達(dá)明顯增加，與空白組相比差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；普飼模型組結(jié)腸上皮細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)減少，N-cadherin 有所增加，但普飼模型組以上兩種表達(dá)與高脂模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3和表2。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)變化(IHC，200×)

表2 各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin 的陽性染色細(xì)胞數(shù)比較(個/視野)

表2 各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin 的陽性染色細(xì)胞數(shù)比較(個/視野)

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與高脂模型組比較，bP<0.01。

組別只數(shù)空白對照組普飼模型組高脂模型組F值P值5 5 5 E-cadeherin陽性染色細(xì)胞數(shù)38.77±4.969 22.38±2.785a 9.583±2.392ab 207.5<0.01 N-cadeherin陽性染色細(xì)胞數(shù)2.667±0.866 5.273±1.794 16.36±3.641ab 90.28<0.01

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐漸上升且趨于年輕化，尤其是45歲以下人群的結(jié)腸癌發(fā)病率也逐漸升高[7]。結(jié)腸癌的誘發(fā)因素眾多，近來研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪的攝入和低纖維飲食導(dǎo)致的肥胖與消化道腫瘤，尤其是結(jié)腸癌的關(guān)系較為密切，并且越來越多的研究一致認(rèn)為肥胖可能是結(jié)腸癌的危險因素之一[8-9]。本研究分別在普通飼料喂養(yǎng)及高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠中，以DSS 及AOM 誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型，發(fā)現(xiàn)普通飼料模型組小鼠結(jié)腸組織腺體消失，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，而高脂飼喂組小鼠的腸上皮細(xì)胞亦失去原有的結(jié)構(gòu)，杯狀細(xì)胞消失，并且出現(xiàn)類似上皮內(nèi)瘤變的病理改變，提示肥胖與結(jié)腸炎-癌進(jìn)展關(guān)系密切，但其具體機(jī)制為何？

研究發(fā)現(xiàn)，肥胖人群血清中的炎性因子水平，如白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子(TNF-α)等較正常人明顯增高，認(rèn)為脂肪的過度堆積易誘發(fā)機(jī)體的促炎氧化應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體處于一種慢性低水平炎癥狀態(tài)，最終導(dǎo)致炎癥因子的持續(xù)分泌[10]，其中TNF-α主要由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌，在腫瘤炎癥微環(huán)境中發(fā)揮啟動慢性炎癥的作用[11]。KUBOTA等[12]還發(fā)現(xiàn)持續(xù)低濃度的TNF-α可促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。但其是如何促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展的呢？

近來研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與EMT有著非常緊密的聯(lián)系[13-14]。EMT 是指具有極性的上皮細(xì)胞向存在于細(xì)胞基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。由于間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞間連接較少的特性，且其與基底層的黏附力較上皮細(xì)胞弱，因此具有更強(qiáng)的運(yùn)動力，這也是發(fā)生EMT 的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲力和運(yùn)動力的重要原因[15]。發(fā)生EMT 的細(xì)胞E-cadherin、Ctokertin、Ocludin 等表達(dá)減少，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 等表達(dá)增加[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，普飼模型組及高脂模型組小鼠的結(jié)腸組織中均出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，同時TNF-α表達(dá)也明顯增加，而高脂肥胖組小鼠結(jié)腸組織中觀察到類似上皮內(nèi)瘤變的病理改變，且TNF-α陽染細(xì)胞數(shù)增加也更為明顯，與普飼模型組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示肥胖時持續(xù)的慢性炎癥可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生。通過進(jìn)一步檢測EMT的相關(guān)標(biāo)志物，筆者發(fā)現(xiàn)高脂模型組小鼠結(jié)腸組織中上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著減少，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)明顯增加，與對照組及普飼模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，進(jìn)一步證實(shí)EMT 與肥胖相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，高脂誘導(dǎo)的肥胖與結(jié)腸癌的發(fā)生關(guān)系密切，其具體機(jī)制可能與肥胖引起的慢性炎癥促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。