胡樂林 陶慧慧 楊陽麗 陶欣榮 唐小龍

1（安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院 淮南232001）

2（安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科 淮南232001）

3（安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室 淮南232001）

結(jié)直腸癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，由于肥胖、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率持續(xù)上升。2015 年，我國新發(fā)病例376 300例，居中國人群惡性腫瘤發(fā)病的第5 位；死亡病例191 000 例，居中國人群惡性腫瘤死因的第5位［1］。不同于歐美國家，我國直腸癌的發(fā)病率高于結(jié)腸癌，且大多數(shù)直腸癌患者就診時已處于局部進(jìn)展期［2］。手術(shù)是局部進(jìn)展期直腸癌的重要治療方式，但是單純的手術(shù)治療療效較差，且局部復(fù)發(fā)率較高［3］。

新輔助放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)，是目前國際推薦的進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。新輔助放化療可以提高直腸癌的手術(shù)切除率、腫瘤局控率及保肛率［4］，但放療抵抗嚴(yán)重制約了新輔助治療的臨床療效，新輔助放化療后只有約20%的患者達(dá)到病理完全緩解（Pathologic complete response，PCR）［5］。目前，國內(nèi)外尚缺乏能夠準(zhǔn)確評判結(jié)直腸癌放射敏感性的分子靶標(biāo)，因此，明確結(jié)直腸癌放療抵抗的機(jī)制和探索結(jié)直腸癌放療敏感性的增敏因素，對提高放療患者的臨床療效至關(guān)重要。

有研究表明，多種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在放射敏感性調(diào)節(jié)中起重要作用。近年來還發(fā)現(xiàn)，多種組蛋白乙酰化酶抑制劑，如Anacardic acid、Garcinol、Curcumin等能增加多種腫瘤細(xì)胞的放療敏 感 性［6-8］。 hALP （human acetytransferase-like protein)也稱為NAT10 （N-Acetyltransferase 10），是一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，在染色體有絲分裂期hALP與hsSUN1（Sad1 unc-84 domain protein 1）共同作用促進(jìn)組蛋白H2B 的Lys15 和H4 的Lys8、Lys12、Lys16 乙酰化［9］。hALP 是否參與放射敏感性的調(diào)節(jié)尚不明確。本研究通過轉(zhuǎn)染SiRNA（Small interfering RNA）片段，觀察沉默hALP基因后結(jié)直腸癌細(xì)胞放射敏感性的改變，為探討結(jié)直腸癌放射抵抗機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

在Oncomine microarray 數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncomine.org）檢測hALP mRNA 在配對結(jié)直腸癌標(biāo)本中的表達(dá)。以“hALP 或NAT10”作為關(guān)鍵詞，使用“Cancervs.Normal analysis”為初級過濾條件，選擇“Colorectal cancervs.Normal analysis”作為分析類型。采用Studentt檢驗(yàn)計(jì)算各組p值。Oncomine網(wǎng)站提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑

CL187細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；hALP SiRNA 和陰性對照SiRNA （Negative control，NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并化學(xué)合成；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Life 公司；AnnexinV/PI （Propidium iodide）雙染凋亡試劑盒購自北京莊盟生物科技有限公司；hALP 抗體、P53 抗體、BAX（BCL2 associated X）抗體、β-actin 抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司；CCK8試劑盒購自合肥睿捷生物技術(shù)有限公司；ECL 顯色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 SiRNA序列

hALPSiRNA序列：5'-CAGCACCACUGCUGAGAAUAAGA-3'； NC 序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和照射條件

CL187 細(xì)胞生長在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代選擇0.25%EDTA的胰酶消化。照射方法為采用瓦里安Triology 直線加速器6 MV X 射線照射，源皮距100 cm，照射野20 cm×20 cm，劑量率300 cGy/min。

1.5 轉(zhuǎn)染SiRNA寡核苷酸

25 cm2培養(yǎng)瓶中接種0.8×106個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后使細(xì)胞能夠達(dá)到80%的匯合。取退火復(fù)性的SiRNA 200 nmol/L，加無血清的DMEM 培養(yǎng)基200 μL，混勻。取脂質(zhì)體14.25 μL，加入200 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基混勻。在5 min中之內(nèi)將以上兩種溶液混合，室溫靜置20 min。加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，換上含有10% 胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)CS） 的DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞接受射線照射，劑量8 Gy，24 h 后收集細(xì)胞利用蛋白印跡法檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.6 克隆存活分析實(shí)驗(yàn)

取合適數(shù)量的細(xì)胞接種于35 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中（以最終每個培養(yǎng)皿中有100 個大于50 個細(xì)胞的克隆為宜），在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后給予射線照射，劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy。照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)12～14 d。0.02%的亞甲藍(lán)染色。計(jì)數(shù)每個培養(yǎng)皿中含50 個細(xì)胞以上的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)）×100%；細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率/對照組克隆形成率。單機(jī)多靶模型擬合劑量存活曲線。相對生物學(xué)效應(yīng)=對照組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)／實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。

1.7 細(xì)胞存活率檢測

CL187細(xì)胞接受遞增劑量的射線照射后，接種于96 孔板，每孔接10 000 個細(xì)胞，設(shè)3 個復(fù)孔。96 孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μL CCK8 溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測定吸光度值。細(xì)胞存活率=（干擾組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.8 細(xì)胞凋亡分析

將貼壁細(xì)胞用胰酶消化，盡量使細(xì)胞呈單個狀脫落。加入含10%FCS 的DMEM 終止胰酶的作用，并將細(xì)胞吹打散，轉(zhuǎn)移到離心管中，常溫1 000 r/min，離心5 min。用4oC 預(yù)冷的1×磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）洗3 遍。每次洗之前，先用殘留的PBS 將細(xì)胞沉淀彈開，防止細(xì)胞結(jié)塊。用1×PBS重新懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。取5×105細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min，離心5 min后棄上清，加入500 μL 的1×Binding buffer 重懸細(xì)胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC，輕輕混勻。在室溫下，避光反應(yīng)15 min。上機(jī)前1 min 再加入2 μL，PI，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 Western blotting檢測

放 射 免 疫 沉 淀 測 定 法 （Radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。測蛋白濃度后，加SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液，95oC 變性5 min 后上樣。按照每塊膠15 mA 的電流進(jìn)行恒流電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，在5%脫脂奶粉的TBS 封閉液中室溫封閉1 h，一抗4oC 孵育過夜。TBS-T 洗膜，每次5 min，洗4 次。二抗按比例稀釋（山羊抗兔HRP 抗體：1︰5 000；山羊抗鼠HRP 抗體：1︰4 000），室溫孵育1 h。棄掉二抗，用TBS-T洗膜，每次5 min，洗4 次。按說明書用ECL 試劑發(fā)光，X 光片壓片、顯影、定影，清水漂洗后自然晾干，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并做好相關(guān)記錄。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)值用xˉ±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，雙側(cè)p＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有意義。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床數(shù)據(jù)庫挖掘hALP在各種腫瘤組織中的表達(dá)情況

2.1.1 Oncomine分析hALP在腫瘤中的表達(dá)概況

利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫在數(shù)據(jù)集中查詢hALP在腫瘤中的表達(dá)概況。紅色方塊表示hALP 過表達(dá)，藍(lán)色方塊表示hALP 低表達(dá)。表達(dá)水平基于基因的百分等級。根據(jù)p＜0.000 1，表達(dá)異常倍數(shù)大于2倍的限定條件，選擇正常組織與腫瘤組織的對比數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1所示（圖中左向箭頭為藍(lán)色方向，右向箭頭為紅色方向）。Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了360 個不同類型的研究結(jié)果，關(guān)于hALP 表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果有10 個，其中8 個研究顯示hALP在結(jié)直腸腫瘤（包括結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤）中高表達(dá)，1 個研究顯示hALP 在乳腺癌中高表達(dá)，1個研究顯示hALP在白血病中高表達(dá)。

2.1.2 Oncomine 分析hALP 在結(jié)直腸腫瘤組織表達(dá)水平

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫的10 個數(shù)據(jù)集共收集了hALP表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果21個，對研究結(jié)果進(jìn)行Meta 分析（見圖2），明確結(jié)直腸腫瘤（包括結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤）臨床標(biāo)本hALP mRNA 的表達(dá)水平。紅色方塊表示結(jié)直腸腫瘤臨床標(biāo)本hALP mRNA 的表達(dá)比正常結(jié)腸組織標(biāo)本高，紅色強(qiáng)度越強(qiáng)提示hALP mRNA 表達(dá)水平越高。研究結(jié)果顯示，中位秩=666，p=7.40×10?9，結(jié)直腸腫瘤癌組織hALP mRNA表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸組織標(biāo)本。右邊的表格描述的這些數(shù)據(jù)集的名稱和每個數(shù)據(jù)集對應(yīng)的患者樣本數(shù)。Oncomine分析顯示hALP在結(jié)直腸腫瘤組織表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸組織標(biāo)本。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析hALP在腫瘤中的表達(dá)（彩色見網(wǎng)絡(luò)版）Fig.1 Analysis of hALP expression in tumors using Oncomine database（color online）

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)直腸腫瘤組織中hALP表達(dá)水平（彩色見網(wǎng)絡(luò)版）Fig.2 Analysis of hALP expression in colorectal tumor sample using Oncomine database（color online）

2.2 結(jié)直腸癌CL187細(xì)胞沉默hALP基因后放射敏感性

CL187 細(xì)胞轉(zhuǎn)染hALPSiRNA 或陰性對照SiRNA 后48 h，Western blotting 檢測hALP 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示hALP SiRNA 靶向沉默hALP基因（圖3（a）、（b））。沉默hALP基因后取合適數(shù)量的CL187細(xì)胞接種于35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并給予細(xì)胞射線照射，劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy。單機(jī)多靶模型擬合劑量存活曲線（圖3（c））。計(jì)算RBE，即RBE=SF2（對照組）／SF2（沉默hALP基因組）。對照組，沉默hALP基因組的SF2分別是0.63、0.5。RBE為1.26。沉默hALP基因組結(jié)直腸癌CL187細(xì)胞放射敏感性增加。

圖3 （a）Western blotting檢測hALP蛋白的表達(dá)情況；（b）Photoshop軟件分析hALP和β-actin條帶的灰度值；（c）克隆增殖實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，*與對照組比較，p＜0.05Fig.3 (a)Western blotting was performed to assess the expression of hALP 48 h after transfection；(b)the expression of hALP was quantified using Photoshop software;(c)cell survival fraction was calculated by clonal proliferation assay,*compared with the control group,p＜0.05

2.3 結(jié)直腸癌CL187 沉默hALP基因后接受射線照射細(xì)胞死亡比例

結(jié)直腸癌CL187 沉默hALP基因后，接受射線照射，劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy，照射后接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用CCK8試劑盒檢測CL187 細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示（圖4）沉默hALP基因組CL187細(xì)胞接受遞增劑量射線照射后細(xì)胞死亡比例較對照組顯著增加（p＜0.05），具體見圖4。

圖4 CCK8試劑盒檢測CL187細(xì)胞的存活率*與對照組相比，p＜0.05Fig.4 CCK8 kit was used to detect the cell viability of CL187 cells，*compared with the control group,p＜0.05

2.4 結(jié)直腸癌CL187沉默hALP基因后接受射線照射細(xì)胞凋亡比例

CL187 細(xì)胞沉默hALP基因后接受射線照射，劑量8 Gy，照射后24 h收集細(xì)胞，Annexin V和PI雙染色，流式細(xì)胞檢測術(shù)檢測CL187 細(xì)胞的凋亡比例。結(jié)果如圖5 所示，結(jié)直腸癌CL187 沉默hALP基因后接受射線照射，細(xì)胞凋亡比例從19.53%增高到36.49%（p＜0.05）。

圖5 （a）流式細(xì)胞分析術(shù)檢測CL187細(xì)胞的凋亡情況；（b）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析凋亡細(xì)胞百分比的改變*與對照組相比，p＜0.05Fig.5 (a)Flow cytometry was used to detect the apoptosis of CL187 cells;(b)statistical analysis of changes in percentage of apoptotic cells,*compared with the control group,p＜0.05

2.5 射線促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞hALP、P53、BAX 的表達(dá)

CL187 細(xì)胞接受0 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy 遞增劑量的射線照射后，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用Western blotting 技術(shù)檢測hALP、P53、BAX蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著吸收劑量的增加，CL187 細(xì)胞內(nèi)hALP、P53、BAX 蛋白的表達(dá)水平增高（圖6）。

圖6 (a)Western blotting檢測hALP、P53、BAX和β-actin的蛋白表達(dá)；(b～d)Photoshop軟件分析hALP、P53、BAX和β-actin條帶的灰度值，以β-actin灰度值為對照，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析hALP(b)、P53(c)和BAX(d)與β-actin灰度值的比，所有數(shù)值用x±s表示；*與對照組相比，p＜0.05Fig.6 (a)The protein expressions of hALP,P53,BAX and β-actin were determined using western blotting,(b～d)expression of hALP(b),P53(c),and BAX(d)was quantified using Photoshop software.The data are normalized to the β-actin and presented as x±s,*compared with the control group,p＜0.05

2.6 沉默hALP 基因后CL187 細(xì)胞接受射線照射，P53、BAX表達(dá)水平

CL187 細(xì)胞轉(zhuǎn)染200 nmol/L 的hALP SiRNA 沉默hALP基因后，接受射線照射，劑量8 Gy，照射后細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Western blotting檢測hALP、P53、BAX 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示射線照射后P53、BAX 表達(dá)水平增高，沉默hALP 基因后射線引起P53、BAX 表達(dá)水平進(jìn)一步增高（圖7）。

圖7 (a)Western blotting檢測hALP、P53、BAX和β-actin的蛋白表達(dá)；(b～d)Photoshop軟件分析hALP(b)、P53(c)、BAX(d)和β-actin條帶的灰度值；*與對照組相比，p＜0.05Fig.7 (a)Western blotting was used to detect the protein expressions of hALP,P53,BAX and β-actin;(b～d)the expression of hALP(b),P53(c),and BAX(d)was quantified using Photoshop software;*compared with the control group,p＜0.05

3 討論

hALP基因位于11 號染色體（11p13），全長2.5 kb，編碼834 個氨基酸，分子量94 kD。hALP蛋白是乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一。hALP蛋白包含N 端乙酰轉(zhuǎn)移酶功能區(qū)、ATP酶功能區(qū)和C端賴氨酸富集區(qū)3 個保守結(jié)構(gòu)域［10］。在細(xì)胞有絲分裂間期hALP 定位于核仁，在細(xì)胞分裂末期hALP 定位于中間體［11］。研究表明hALP的表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位與多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)［12-15］。Shen 等［11］運(yùn)用免疫組化和組織芯片技術(shù)對155例肉瘤，28例軟組織良性腫瘤或軟組織腫瘤樣病變組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hALP在多種軟組織肉瘤中高表達(dá)，并且hALP的表達(dá)水平與腫瘤的組織分級密切相關(guān)。Zhang 等［12］對17 例肝癌患者的新鮮肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行Real-time PCR 分析，并對186例肝癌患者的肝癌組織和癌旁組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中hALP的表達(dá)水平高于癌旁組織，hALP是肝癌預(yù)后不良的標(biāo)志。Ma 等［14］使用Remodelin（hALP 的抑制劑）以及基因干擾技術(shù)降低hALP的表達(dá)，肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力和侵襲力都降低。韓斐等［16］應(yīng)用免疫組化技術(shù)對80 例鼻腔鼻竇黏膜黑色素瘤患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)hALP的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。梁佩淇等［17］應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對48例急性髓細(xì)胞白血病患者及20例非惡性血液疾病患者或健康人的骨髓單個核細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)急性髓細(xì)胞白血病患者h(yuǎn)ALP mRNA表達(dá)水平高于對照組，并且hALP mRNA的高表達(dá)與急性髓細(xì)胞白血病預(yù)后不良密切相關(guān)。Zhang等［15］對結(jié)直腸癌組織進(jìn)行免疫組化分析時發(fā)現(xiàn)，在正常結(jié)直腸組織中hALP定位于核仁，在結(jié)直腸癌組織中hALP向胞漿和細(xì)胞膜等亞細(xì)胞器重新分布，hALP的亞細(xì)胞定位與結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)。尚不明確hALP 是否參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，為探討hALP 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過對臨床數(shù)據(jù)庫挖掘，發(fā)現(xiàn)hALP在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中表達(dá)量顯著高于正常結(jié)直腸組織標(biāo)本（圖1、2），提示hALP 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。hALP是否參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性調(diào)控尚不明確。

SiRNA 是一種小的核苷酸片段，能通過堿基互補(bǔ)識別特異的靶mRNA，并與之結(jié)合并引起靶mRNA 的降解，從而抑制靶基因表達(dá)［18］。本研究利用hALP 的特異SiRNA 序列干擾hALP 的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞放射敏感性的影響?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CL187 細(xì)胞沉默hALP基因組克隆形成率較其對照組明顯降低（圖3），表明抑制細(xì)胞內(nèi)hALP蛋白的表達(dá)后，對射線照射誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成率下降有促進(jìn)作用。CCK8試劑盒檢測細(xì)胞存活率分析發(fā)現(xiàn)，CL187 細(xì)胞沉默hALP基因組接受遞增劑量射線照射后細(xì)胞死亡比例較對照組顯著增加（圖4），這與圖3 的結(jié)果一致，證明沉默hALP基因增加結(jié)直腸癌CL187細(xì)胞的放射敏感性。

腫瘤細(xì)胞的放射敏感性受多種因素的影響，細(xì)胞凋亡是影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的重要因素［19］。為探討沉默hALP基因是否通過影響結(jié)直腸癌CL187 細(xì)胞凋亡的比例而影響腫瘤的放射敏感性，本研究利用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，hALP沉默組CL187 細(xì)胞接受射線照射引起的細(xì)胞凋亡比例增加（圖5），提示hALP基因影響結(jié)直腸癌CL187 細(xì)胞凋亡參與腫瘤的放射敏感性的調(diào)控。P53 和BAX 蛋白在細(xì)胞凋亡中起重要的調(diào)控作用［20］。hALP是否通過P53、BAX調(diào)控細(xì)胞凋亡參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性的調(diào)控尚不明確。本研究利用Western blotting 證實(shí)，隨著劑量的增加，hALP 和凋亡相關(guān)蛋白P53、BAX 表達(dá)水平增高（圖6），提示hALP 極有可能通過影響P53、BAX 的表達(dá)，參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性的調(diào)控。為進(jìn)一步明確hALP 是否通過P53、BAX調(diào)控細(xì)胞凋亡參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性的調(diào)控，CL187 細(xì)胞沉默hALP基因后接受射線照射（8 Gy），Western blotting 檢 測hALP、P53、BAX 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示射線照射后P53、BAX 表達(dá)水平增高，沉默hALP基因后射線引起P53、BAX表達(dá)水平進(jìn)一步增高（圖7）。這些研究表明，P53、BAX 在hALP 對結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性的調(diào)控中起重要作用。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，hALP 可能通過P53、BAX調(diào)控細(xì)胞凋亡參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性的調(diào)控；但hALP對結(jié)直腸癌放射抗拒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用及其具體分子機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。研究結(jié)直腸癌放療敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于闡明hALP在結(jié)直腸癌放射敏感性中的地位，有利于在hALP差異表達(dá)的結(jié)直腸癌患者中篩選放射治療的潛在獲益人群。