丁華杰，葉云，安歡，高強(qiáng)，趙彬樂，羅容青，鐘英英

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006)

虎杖，蓼科多年生草本植物，在我國主要分布于華東、華中、華南等地。虎杖是一種著名的中藥植物和食品添加劑[1]，如虎杖的嫩莖可做蔬菜食用，其根可做飲料。白藜蘆醇是虎杖的主要植物成分，是一種具有多種保健功能的多酚類天然化合物[2]，是生物體受到外界刺激時自身合成的[3,4]，并認(rèn)為這種化合物的生成是植物體在受到感染或病原侵害時的一種反應(yīng)，稱為“植物抗毒素”[5]。白藜蘆醇有較好的抗氧化、抗腫瘤活性等作用[6,7]。近年來，白藜蘆醇已成為預(yù)防癌癥的首選營養(yǎng)物質(zhì)，在食品、膳食補(bǔ)充劑、保健品等領(lǐng)域中有重要的價值[8]。

本研究以虎杖白藜蘆醇提取率為考察指標(biāo)，初步探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波溫度、功率、時間對虎杖中白藜蘆醇提取率的影響，選出最佳工藝，并探討白藜蘆醇對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響，為進(jìn)一步探討白藜蘆醇的食理作用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；阿卡波糖、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷等：上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備及白藜蘆醇含量的測定

虎杖：購自廣西柳州市譚中菜市，洗凈，用萬能粉碎機(jī)打粉，置于陰涼干燥處密封備用。稱取虎杖粉1.00 g，按料液比1∶15(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇，微波設(shè)定條件為600 s、50 ℃、500 W，回收乙醇。用乙酸乙酯萃取濃縮的浸膏，在50～60 ℃下減壓蒸餾至干燥，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇定容至100 mL，再取0.5 mL定容到50 mL，測定其吸光度。計(jì)算3次的平均提取率及RSD。白藜蘆醇提取率的計(jì)算公式為：

式中：c為溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)；n為溶液稀釋倍數(shù)；V為溶液體積(mL)；m為原料質(zhì)量(mg)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，配制成濃度梯度為0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0 μg/mL的對照品溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g虎杖粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，微波條件設(shè)定為50 ℃、500 W、600 s，改變料液比的比例為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，測定吸光度。

1.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g虎杖粉，微波條件設(shè)定為50 ℃、500 W、600 s、料液比為1∶20，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、70%、80%，測定吸光度。

1.3.3 微波時間對提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g虎杖粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，微波條件設(shè)定為50 ℃、500 W，料液比為1∶20，改變微波時間為400,500,600,700,800 s，測定吸光度。

1.3.4 微波溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g虎杖粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比分別固定為60%、1∶20，微波條件設(shè)定為500 W、600 s，改變微波溫度為30,40,50,60,70,80 ℃，測定吸光度。

1.3.5 微波功率對提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g虎杖粉，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇進(jìn)行微波萃取，微波條件設(shè)定為50 ℃、500 W、600 s，改變微波功率為300,400,500,600,700,800 W，測定吸光度。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)[9]，以白藜蘆醇提取率作為指標(biāo)，確定白藜蘆醇提取的顯著影響條件并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.5 白藜蘆醇提取液對α-淀粉酶活性的影響

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制濃度梯度為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的葡萄糖溶液，按照趙叢叢等[10]的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 α-淀粉酶活力測定

參照文獻(xiàn)[11]建立反應(yīng)體系：在70 ℃條件下將1 mL α-淀粉酶(0.436 mg/mL)、1 mL 1%淀粉溶液分別預(yù)熱5 min，繼續(xù)混勻反應(yīng)5 min；加入2 mL DNS，沸水浴5 min后，待溶液冷卻至室溫后加水稀釋至50 mL，500 nm下測定吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 α-淀粉酶米氏常數(shù)

改變淀粉溶液的濃度：1/0.40，1/0.35，1/0.30，1/0.25，1/0.20，1/0.15，1/0.10，1/0.05 mg/mL，按照酶活測定體系操作，500 nm下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的還原糖量，得出不同底物濃度(s)下的反應(yīng)速度(v)，最后用雙倒數(shù)法作圖得到米氏常數(shù)。

1.5.4 白藜蘆醇對α-淀粉酶抑制試驗(yàn)

以上述方法，按表1操作，在反應(yīng)體系中加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的白藜蘆醇提取液。沸水浴顯色后，待降至室溫，定容至10 mL，測定吸光值。

表1 白藜蘆醇對α-淀粉酶活性抑制體系表Table 1 Inhibition system of resveratrol on α-amylase activity mL

白藜蘆醇提取液對α-淀粉酶的抑制率：

考慮到白藜蘆醇提取液中乙醇的影響，配制不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，測定乙醇對酶的抑制率，根據(jù)得到的乙醇抑制曲線選取合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)溶解提取物浸膏，稀釋成不同濃度的溶液，用來進(jìn)行α-淀粉酶的抑制試驗(yàn)，根據(jù)吸光值計(jì)算抑制率。然后繪制阿卡波糖抑制曲線、白藜蘆醇提取液抑制曲線以及消除乙醇作用后的白藜蘆醇提取液實(shí)際抑制曲線。

1.6 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活性的影響

1.6.1 對硝基苯酚最大吸收波長測定

取對硝基苯-α-D-葡萄糖苷0.151 g，取pH為6.8的磷酸緩沖液溶解并定容至50 mL，得母液，濃度為10 mmol/L。取1 mL上述溶液定容至100 mL，取1 mL加入1 mol/L的Na2CO3溶液2 mL，混勻后于300～500 nm處掃描吸收光譜。

1.6.2 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用PBS將母液分別稀釋為50,60,70,80,90,100 μmol/L。于400 nm處測定其吸光度，繪制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 α-葡萄糖苷酶活力測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[12,13]建立反應(yīng)體系：0.5 mL 1% α-葡萄糖苷酶、1 mL底物PNPG(1 mmol/L)分別在60 ℃水浴中預(yù)熱10 min后混勻，反應(yīng)10 min后加入2 mL Na2CO3(1 mol/L)，并在400 nm處測定吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6.4 α-葡萄糖苷酶米氏常數(shù)

改變底物濃度：1/0.8,1/0.7,1/0.6,1/0.5,1/0.4,1/0.3 mmol/L，按1.5.3的方法操作，于400 nm測定吸光值，然后用雙倒數(shù)法作圖得到米氏常數(shù)。

1.6.5 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)

參照1.5.3的方法建立反應(yīng)體系，見表2。在反應(yīng)體系中加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的白藜蘆醇提取液。待反應(yīng)終止用蒸餾水依次定容至10 mL，于400 nm處測其吸光度值。

表2 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活性抑制體系Table 2 Inhibition system of resveratrol on α-glucosidase activity mL

白藜蘆醇提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制率：

考慮到白藜蘆醇提取液中乙醇對試驗(yàn)的影響，配制不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，測定乙醇對酶的抑制率，根據(jù)測得的乙醇抑制曲線，選取合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)溶解提取物浸膏，然后稀釋成不同濃度的溶液，用來進(jìn)行體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)，根據(jù)吸光值計(jì)算抑制率。制作阿卡波糖抑制曲線、白藜蘆醇提取液抑制曲線、減去乙醇作用后的白藜蘆醇提取液修正抑制曲線。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇最大吸收波長的測定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

白藜蘆醇在300～310 nm的吸收光譜圖見圖1。

圖1 白藜蘆醇在300～310 nm的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of resveratrol at 300～310 nm

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of resveratrol

由圖2可知，線性回歸方程為y=0.1746x+0.0051，R2=0.9998，在0～4.8 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

3次試驗(yàn)測得白藜蘆醇的平均提取率見表3，RSD<10%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重 復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表Table 3 Record form of repeated experimental data %

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，提取白藜蘆的醇最適料液比是1∶20。由圖4可知，提取白藜蘆醇的最佳時間為600 s。由圖5可知，提取白藜蘆醇的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)是60%。由圖6可知，白藜蘆醇的最適提取溫度是50 ℃。由圖7可知，提取白藜蘆醇的最適微波功率是700 W。

圖3 料液比對白藜蘆醇含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the content of resveratrol

圖4 微波時間對白藜蘆醇含量的影響Fig.4 Effect of microwave time on the content of resveratrol

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇含量的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on the content of resveratrol

圖6 微波溫度對白藜蘆醇含量的影響Fig.6 Effect of microwave temperature on the content of resveratrol

圖7 微波功率對白藜蘆醇含量的影響Fig.7 Effect of microwave power on the content of resveratrol

2.4 正交法優(yōu)化

正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment design

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment results

由極差R的大小得出因素的影響大小為A>B>D>C，最佳的提取工藝為A2B2C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶20，微波條件設(shè)定為50 ℃、700 W、700 s。按照最佳工藝條件平行提取3次，得到白藜蘆醇平均提取率為2.14%，見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Verification experiment results %

2.5 白藜蘆醇提取液對α-淀粉酶活性的影響

2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。y=21.487x-0.0116，R2=0.9992，曲線在0～0.0462 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of glucose

2.5.2 α-淀粉酶活力測定

表7 α-淀粉酶活測定結(jié)果Table 7 Determination result of α-amylase activity

由表7可知，按照反應(yīng)體系操作完畢后，500 nm下測定吸光值，平行測定3次，α-淀粉酶的一個酶活力單位為0.280 mg，即3571 U/g。

2.5.3 α-淀粉酶米氏常數(shù)

圖9 α-淀粉酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.9 Lineweaver-Burk curve of α-amylase

2.5.4 α-淀粉酶抑制試驗(yàn)

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對α-淀粉酶的抑制率見圖10，考慮到大于30%的乙醇溶解白藜蘆醇不利于做抑制試驗(yàn)，故可選用10%或20%。

圖10 乙醇對α-淀粉酶的抑制曲線Fig.10 Inhibition curve of ethanol on α-amylase

圖11 白藜蘆醇提取物對α-淀粉酶的抑制曲線Fig.11 Inhibition curve of resveratrol extract on α-amylase

由圖11可知，當(dāng)溶液濃度為0.6 mg/mL時，白藜蘆醇提取液抑制率為89.56%，消除乙醇作用后，實(shí)際抑制率為69.42%。阿卡波糖在溶液濃度為0.3 mg/mL時抑制率達(dá)86.13%。

2.6 白藜蘆醇提取液對α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.6.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖12 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of p-nitrophenol

對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖12，可得線性回歸方程y=0.0061x+0.0054，R2=0.9994，在0～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 α-葡萄糖苷酶活力

由表8可知，將上述反應(yīng)體系加入碳酸鈉，并在400 nm下測定吸光值，平行測定3次，α-淀粉酶的一個酶活力單位為4.39 mg，即228 U/g。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶米氏常數(shù)

圖13 α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.13 Lineweaver-Burk curve of α-glucosidase

2.6.4 白藜蘆醇提取液對α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)

圖14 乙醇對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.14 Inhibition curve of ethanol on α-glucosidase

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖14，考慮到用來溶解白藜蘆醇的乙醇濃度不宜過高，否則會影響后續(xù)的抑制試驗(yàn)，故選用10%的乙醇。

圖15 白藜蘆醇提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.15 Inhibition curve of resveratrol extract on α-glucosidase

白藜蘆醇提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖15，濃度為0.3 mg/mL時白藜蘆醇的抑制效果最佳，實(shí)際抑制率達(dá)到74.39%，略高于同濃度的阿卡波糖的抑制效果。

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，微波法萃取虎杖中白藜蘆醇的最佳提取工藝為：料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，微波參數(shù)設(shè)置為700 W、50 ℃、700 s。在此條件下，白藜蘆醇平均提取率達(dá)2.14%。

體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)表明，虎杖白藜蘆醇具有較好的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性作用。0.6 mg/mL的白藜蘆醇對α-淀粉酶的實(shí)際抑制率為69.42%。而濃度低于0.3 mg/mL的白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶的抑制效果略好于同濃度的阿卡波糖，其中濃度為0.3 mg/mL白藜蘆醇的抑制效果最佳，實(shí)際抑制率達(dá)到74.39%。

本研究通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化白藜蘆醇提取條件，并對其體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行研究，為虎杖中白藜蘆醇被進(jìn)一步開發(fā)為膳食補(bǔ)充劑提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。