鄧春麗，韋芳蘭，蘇輝蘭，陳振林，段振華*

(1.賀州學院 食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899； 2.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899)

芒果(MangiferaindicaLinn.)是漆樹科杧果屬常綠大喬木，原產于印度，在我國海南、廣西、廣東、云南、福建和臺灣等地有廣泛種植，廣西芒果種植面積占全國種植面積的1/4以上[1，2]。芒果果實營養(yǎng)豐富，含糖量在7%以上，磷、鈣、鐵等礦物質含量較高，維生素A、B、C含量均高于普通水果，其中維生素A的前體胡蘿卜素含量豐富[3]。芒果中沒食子酸、香豆素、芒果苷、香草醛、單寧等多酚物質含量豐富，具有抗氧化、抗癌、防治心腦血管疾病、去痰止咳等功效[4，5]。目前芒果深加工產品較少，主要有芒果罐頭、芒果汁、芒果果醬、芒果果脯等[6]。

近年來，隨著人們生活水平的提高，蘋果醋、山楂醋、桑果醋等各種果醋飲品不斷投入研發(fā)并投放市場，受到越來越多消費者的青睞。芒果經發(fā)酵處理制成果醋，既能解決芒果采后易腐爛、難貯藏的問題，又能豐富果醋市場。本研究在優(yōu)化酒精發(fā)酵工藝的基礎上，利用響應面法優(yōu)化芒果果醋的醋酸發(fā)酵工藝條件，為芒果果醋的開發(fā)與工業(yè)化生產研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒果：賀州本地市售的青皮芒；蔗糖：市售；氫氧化鈉、無水乙醇等：均為分析純；葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、瓊脂等：均為生化試劑；果膠酶(10000 U/mL)：諾維信生物技術有限公司；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌(菌號AS1.41)：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與試劑

JD-322 榨汁機 金達電器公司；ZWYR-D2403恒溫振蕩搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司；YP1201N電子天平 上海儀器總廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；LH-B55數顯折光儀 杭州陸恒生物科技有限公司；FE20精密pH計 梅特勒-托利多集團；SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋 重慶雅馬拓科技有限公司；DL-CJ-2N超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DA-130酒精計 日本京都電子公司；UVl901PC紫外可見分光光度計 上海奧析科學儀器有限公司；PAL-1糖度計 日本 ATAGO(愛拓)科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

試驗時選擇完好無損的芒果用流動水沖洗干凈后去皮、去核置于打漿機中，加入0.01%維生素C(按果重計)，破碎壓榨，加入0.01%果膠酶(以原果果汁計)40 ℃保溫2 h進行酶解，獲得芒果汁，備用。

菌種活化：分別參考王乃馨等[7]和李英等[8]的方法對果酒酵母和醋酸菌進行活化。

1.4 試驗內容

1.4.1 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化

將活化后的酵母種子液接入到經果膠酶處理后的芒果汁中，進行酒精發(fā)酵，根據預試驗結果，篩選料液比(芒果果汁∶蒸餾水，V/V)、初始糖度、酵母接種量、發(fā)酵溫度為影響因素，酒精度為指標，采用正交試驗方法，優(yōu)化芒果酒精發(fā)酵工藝條件。

1.4.2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化

將活化后的醋酸菌種子液接入到初始酒精度為6%的芒果果酒中進行醋酸發(fā)酵。分別以接種量、裝料量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為影響因素，以醋酸產量(酸度)為響應值，采用四因素三水平的響應面試驗優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝條件，試驗因素和水平設計見表1。

表1 響應面試驗水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.5 測定方法

使用酒精計、糖度計、pH計分別測定酒精度、糖度、pH值；酸堿中和滴定法測定酸度。

2 結果與分析

2.1 芒果酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

綜合預試驗及單因素試驗結果，以料液比 (1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)、初始糖度(14%、16%、18%、20%)、酵母接種量(0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)、發(fā)酵溫度(28，30，32，34 ℃)為影響因素，以酒精度為考察指標，進行正交試驗，正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests

續(xù) 表

由表2可知，發(fā)酵溫度及料液比對芒果酒精發(fā)酵有較大影響，各因素對芒果酒精發(fā)酵階段的酒精度影響大小順序依次為：發(fā)酵溫度>料液比>初始糖度>酵母接種量。芒果酒精發(fā)酵條件優(yōu)化組合為A2B3C2D4,即料液比為1∶2(V/V)，初始糖度為18%，酵母接種量為0.2%，發(fā)酵溫度為34 ℃。在優(yōu)化組合條件下進行驗證試驗，結果表明芒果酒精發(fā)酵酒精度為6.62%。對此條件下發(fā)酵3 d所得的芒果果酒進行過濾及成分調整后，接種醋酸菌進行醋酸發(fā)酵。

2.2 芒果醋酸發(fā)酵工藝單因素試驗

在前期試驗基礎上，將芒果酒精發(fā)酵后的發(fā)酵液酒精度調整為6.0%，搖床轉速為120 r/min，考察醋酸菌接種量(%)、發(fā)酵溫度(℃)、裝料量(%)及發(fā)酵時間(d)4個影響因素對醋酸發(fā)酵的影響。

2.2.1 接種量對芒果醋發(fā)酵的影響

固定發(fā)酵條件為溫度30 ℃，裝液量60%，發(fā)酵時間5 d，考察不同醋酸菌接種量(4%、6%、8%、10%、12%)對醋酸發(fā)酵的影響，試驗結果見圖1。

圖1 接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of inoculum size on acetic fementation

由圖1可知，發(fā)酵液酸度隨著接種量增加呈先增后減的趨勢，接種量為8%時達到峰值。在一定的發(fā)酵液中營養(yǎng)物質相對固定，當接種量過低時，發(fā)酵液中的菌體較少，發(fā)酵不徹底，導致醋酸產量較低；接種量過大，需要更多的營養(yǎng)物質用于菌體自身的生長繁殖，從而導致用于生成醋酸的底物較少，影響醋酸產量[9，10]。

2.2.2 發(fā)酵溫度對芒果醋酸發(fā)酵的影響

固定醋酸菌接種量為8%，裝液量為60%，發(fā)酵時間為5 d，考察不同發(fā)酵溫度(26，28，30，32 ℃)對醋酸發(fā)酵的影響，試驗結果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on acetic fermentation

由圖2可知，發(fā)酵液酸度隨著發(fā)酵溫度逐漸升高呈先增后減的趨勢，32 ℃時達到峰值。出現這種現象的原因是在一定空間里，溫度過高會加速菌體的生長，使得菌體提前老化，導致發(fā)酵液酸度降低[11,12]。

2.2.3 裝料量對芒果醋酸發(fā)酵的影響

醋酸菌專性好氧，其生長需要足夠的氧氣，氧氣充足的條件下，菌體生長繁殖旺盛，氧氣不足則會抑制發(fā)酵的進行[13]。不同的裝料量對發(fā)酵液的供氧量不同。固定發(fā)酵條件為醋酸菌接種量8%、發(fā)酵溫度32 ℃，連續(xù)發(fā)酵9 d，考察不同裝料量(20%、30%、40%、50%、60%)對醋酸發(fā)酵的影響，試驗結果見圖3。

圖3 裝料量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of loading volume on acetic fermentation

由圖3可知，發(fā)酵初期發(fā)酵液中醋酸含量增加較快，且裝料量越低，產酸能力越強,當發(fā)酵時間為7 d時，不同裝料量的發(fā)酵液中酸度均達到最大值；在7 d以后醋酸產量開始降低，可能是由于菌體生長繁殖消耗過多的營養(yǎng)物質及發(fā)酵后期菌體老化等[14]。

2.2.4 發(fā)酵時間對芒果醋酸發(fā)酵的影響

固定發(fā)酵條件為醋酸菌接種量8%、發(fā)酵溫度32 ℃，裝料量30%，考察不同發(fā)酵時間(3，4，5，6，7，8，9 d)對醋酸發(fā)酵的影響，試驗結果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of fermentation time on acetic fermentation

由圖4可知，發(fā)酵初期發(fā)酵液酸度增加較快，發(fā)酵7 d時，發(fā)酵液的酸度達到峰值，繼續(xù)發(fā)酵，則發(fā)酵液中的酸度有下降的現象。原因可能是發(fā)酵前期發(fā)酵液中營養(yǎng)物質充足，使菌體大量繁殖，代謝產物速度快；7 d后進入發(fā)酵后期，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質已被過多消耗且菌體開始老化導致醋酸產量稍有降低或趨于平穩(wěn)。

2.3 芒果醋酸發(fā)酵工藝響應面試驗優(yōu)化

根據單因素試驗結果，以酸度(Y)為評價指標，選取醋酸菌接種量(6%、8%、10%)、發(fā)酵溫度(30，32，34 ℃)、裝料量(20%、30%、40%)和發(fā)酵時間(6，7，8 d) 4個因素，應用Box-Benhnken對芒果醋酸發(fā)酵工藝進行響應面分析試驗，試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 響應面二次回歸方程模型方差分析結果Table 4 Variance analysis results of response surface quadratic regression equation model

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3進行回歸分析，得到醋酸產量(酸度Y)對自變量接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、裝料量(C)和發(fā)酵時間(D)的二次多項回歸方程為：

Y=4.109-0.15A+0.174B-0.027C+0.011D-0.095AB-0.061AC+0.112AD-0.122BC-0.87BD+0.007CD-0.485A2-0.48B2-0.494C2-0.537D2。

由表4可知，該模型的P<0.0001，回歸模型極顯著，失擬項不顯著(P=0.0704>0.05)，說明所得模型擬合性較好。相關系數R2=0.9312,調整系數RAdj2=0.8623，信噪比(11.22)遠大于4，說明預測值與試驗值有較好的相關性，試驗誤差較小。因此可用此模型對芒果果醋的發(fā)酵工藝條件結果進行分析和預測。

模型方程的一次項A、B的P值均小于0.05，說明接種量、發(fā)酵溫度對結果影響顯著，且一次項各因素對醋酸產量影響的大小順序為：發(fā)酵溫度(B)>接種量(A)>裝料量(C)>發(fā)酵時間(D)。二次項A2、B2、C2、D2的P值均小于 0.01，具有極高的顯著性，說明醋酸產量的變化相對復雜，各因素對醋酸產量的影響不是簡單的線性關系，響應面效應顯著，相應的響應面見圖5。

圖5 接種量、發(fā)酵溫度、裝料量和發(fā)酵時間的交互 作用對芒果醋酸發(fā)酵影響的響應面Fig.5 Response surface figures of the interaction of inoculum size, fermentation temperature, loading volume and fermentation time on mango acetic acid fermentation

由圖5可知，該結果與單因素試驗結果一致，隨著因素水平的增大，酸度呈先增大后逐漸減小的趨勢。利用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化分析，得到芒果醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為接種量7.74%，發(fā)酵溫度32.4 ℃，裝料量29.56%，發(fā)酵時間6.98 d，根據模型預測得到的理論最大酸度為4.04 g/dL。

2.4 驗證試驗

為了驗證模型的可靠性和實用性，將工藝條件調整為：接種量7.7%，發(fā)酵溫度32.5 ℃，裝料量30%，發(fā)酵時間7 d，在此條件下測得芒果果醋的酸度為3.99 g/dL，與最優(yōu)條件下的理論值(4.04 g/dL)接近，說明經響應面法優(yōu)化的芒果果醋發(fā)酵工藝是可行的，具有實際應用價值。

2.5 芒果果醋質量評價

在優(yōu)化條件下發(fā)酵得到的芒果果醋按照GB 18187—2000《釀造食醋》、GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標準》的要求進行理化、衛(wèi)生指標檢測，結果如下：總酸(以乙酸計)含量為3.99g/dL；可溶性無鹽固形物含量為1.86g/dL,菌落總數為2CFU/mL；大腸菌群為0MPN/dL，致病菌(金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌)、游離礦物、總砷(以As計)、鉛(Pb)、黃曲霉毒素B1均未檢出；且芒果果醋澄清，具有醋味柔和、芒果典型香氣和色澤的特點。果醋的理化、衛(wèi)生指標均符合國家標準。

3 結論與討論

正交試驗結果表明各考察因素對酒精度影響大小順序依次為：發(fā)酵溫度>料液比>初始糖度>酵母接種量。芒果酒精發(fā)酵條件優(yōu)化組合為A2B3C2D4，即料液比為1∶2(V/V)，初始糖度為18%，酵母接種量為0.2%，發(fā)酵溫度為34 ℃；此條件下發(fā)酵所得芒果果酒的酒精度為6.62%。

通過響應面試驗優(yōu)化出的芒果醋酸發(fā)酵最佳工藝條件為：接種量7.7%，發(fā)酵溫度32.5 ℃，裝料量30%，發(fā)酵時間7 d，在此條件下發(fā)酵所得芒果果醋的酸度為3.99 g/dL。經質量評價得出該芒果果醋質量符合GB 18187—2000《釀造食醋》、GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標準》的要求，且果醋澄清，具有醋味柔和、芒果典型香氣和色澤的特點。在本試驗范圍內建立的模型準確有效，可用來預測設定條件范圍及其周圍的芒果果醋發(fā)酵工藝參數，對發(fā)酵芒果果醋的后續(xù)研究及工業(yè)化生產具有較好的參考價值。