趙 璇

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,石家莊 050026)

洋蔥(Alliumcepa)，又名球蔥、玉蔥等，系百合科蔥屬二年生草本植物[1]。因其具有豐富的營養(yǎng)成分、寶貴的藥用價(jià)值和特殊的氣味，受到消費(fèi)者的喜愛和研究者的青睞，還被譽(yù)為“蔬菜皇后”。洋蔥的主要活性成分有蒜素類化合物、甾體皂苷、類黃酮類物質(zhì)等，很多都具有抗氧化、抗腫瘤的功效，同時(shí)中醫(yī)醫(yī)學(xué)認(rèn)為洋蔥味甘且辛，性平，可以調(diào)理腸胃[2]。

近年來，生物活性肽，尤其是抗氧化肽受到了廣泛關(guān)注。研究表明[3，4]，抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)多余的自由基，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受損傷，維持細(xì)胞正常機(jī)能。但是現(xiàn)有報(bào)道幾乎集中在了動(dòng)物蛋白和大豆蛋白上，蔬菜類蛋白質(zhì)及多肽的抗氧化性能卻少有報(bào)道[5，6]。洋蔥蛋白質(zhì)雖然并不高(1.8%左右)，但是已有報(bào)道說明洋蔥蛋白及其水解產(chǎn)物具有抗氧化的性質(zhì)，但是這方面的報(bào)道還是較少，多肽的制備和純化過程也并不明晰，故本實(shí)驗(yàn)對洋蔥蛋白的提取、洋蔥多肽的制備和性質(zhì)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，為洋蔥的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋蔥：購于河北省石家莊市某菜市場；木瓜蛋白酶(5×105U/g)：南寧龐博生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；精密電動(dòng)攪拌器 常州丹瑞有限公司；2300 自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士FOSS 公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 洋蔥蛋白(Protein)的制備

洋蔥剁碎后按照料液比1∶5(質(zhì)量比)加入蒸餾水，磁力攪拌2 h后在4 ℃冰箱靜置過夜，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該溶液的pH至10.0，超聲輔助提取20 min后以6000 r/min的轉(zhuǎn)速、4 ℃的溫度離心20 min，取上清液。用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)該上清液的pH至4.0，于4 ℃冰箱靜置沉淀5 h后以8000 r/min的轉(zhuǎn)速、4 ℃的溫度離心10 min，棄上清，取沉淀。沉淀水洗至中性，將其冷凍干燥72 h則為洋蔥蛋白。

1.3 粗洋蔥多肽(P)的制備

稱取一定量上述洋蔥蛋白，按料液比1∶4(質(zhì)量比)加入蒸餾水和1600 U/g蛋白質(zhì)的木瓜蛋白酶，45 ℃恒溫水浴2，4，6，8 h，水解結(jié)束后于95 ℃水浴滅酶10 min，即為蛋白解液，將酶解液冷凍干燥72 h則為粗洋蔥多肽(分別為P-2、P-4、P-6、P-8)[7]。

1.4 粗洋蔥多肽水解度(DH)的測定[8]

DH(%)=[帶魚糜水解液氨基氮(mg/g)-帶魚糜溶液水解前氨基氮(mg/g)]/帶魚糜原料全氮(mg/g)×100。

式中：氨基氮含量的測定采用甲醛電位滴定法；全氮含量的測定采用凱氏定氮法。

1.5 粗洋蔥多肽分子量(Mw)分布測定[9]

在HPLC系統(tǒng)上使用凝膠過濾分析粗洋蔥多肽的分子量分布。將冷凍干燥的粉末(5 mg)溶于30%乙腈緩沖液(1 mL，0.1% TFA)流動(dòng)相中。用SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱分離樣品(50 μL)，其分離分子量范圍為7000～100 Da的肽。使用的標(biāo)準(zhǔn)品是細(xì)胞色素c(Mw12400)、抑肽酶(Mw6500)、Vit B12(MW1355)，GSSG(MW613)和甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(Mw189)。檢測波長為220 nm，溫度為室溫。

1.6 洋蔥蛋白、粗洋蔥多肽氨基酸組分測定[10]

稱取一定量樣品，加入6 mol/L HCl(含有1%苯酚)，在105 ℃水解24 h，定容，成水解液。吸取20 mL上述水解液真空干燥，樣品衍生，再次進(jìn)行干燥。將樣品稀釋液與干燥樣品混合溶解，以10000 r/min的轉(zhuǎn)速、4 ℃的溫度離心10 min，高效液相分析。色譜柱：PICO-TAG柱，長度150 mm；流動(dòng)相A：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 6.6)；流動(dòng)相B：60%乙腈溶液；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min。

1.7 膜超濾法分離純化洋蔥多肽[11]

將洋蔥蛋白和洋蔥多肽凍干粉溶于超純水，用福林酚法測定蛋白質(zhì)含量，調(diào)節(jié)溶液蛋白質(zhì)濃度為30 mg/mL。分別用截留分子量為10，5，1 kDa超濾膜對洋蔥多肽溶液進(jìn)行分級分離。調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為200 r/min，超濾膜板出口壓力為250 kPa。P-2、P-4、P-6、P-8均收集不同分子量范圍的幾個(gè)組分：P-1(Mw>10 kDa)、P-2(Mw=5～10 kDa)、P-3(Mw=1～5 kDa)和P-IV(Mw<1 kDa)。各組分多肽分別冷凍干燥72 h，即得洋蔥多肽純化組分。

1.8 清除DPPH·能力測定[12]

用超純水將洋蔥蛋白、粗洋蔥多肽、純化洋蔥多肽都配制成5 mg/mL的溶液。用這個(gè)濃度的溶液測定DPPH·清除能力。參照文獻(xiàn)方法，配制1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，取2 mL置于離心管中，加入2 mL上述蛋白/多肽溶液，漩渦混勻，25 ℃下靜置避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定混合溶液的吸光度值A(chǔ)x。同時(shí)，無水乙醇在517 nm處的吸光度值為參比，記為A0。蛋白/多肽溶液本身在517 nm處的吸光度值為Ax0。

DPPH=[A0-(Ax- Ax0)]/A0×100%。

式中：A0為無水乙醇參比溶液的吸光度值；Ax為混合溶液的吸光度值；Ax0為蛋白/多肽溶液的本底吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0、Origin 8.1進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗洋蔥多肽的水解度(DH)

在木瓜蛋白酶的作用下，洋蔥蛋白質(zhì)大分子逐漸被酶解成小分子多肽。水解度能夠衡量水解的程度，反映酶的作用強(qiáng)度。洋蔥蛋白水解度隨水解時(shí)間的變化見圖1。

圖1 水解時(shí)間對水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

由圖1可知，隨著水解時(shí)間的延長，水解度先急劇上升后緩慢上升趨于平穩(wěn)。水解2 h后，水解度僅僅為12.6%；水解6 h基本達(dá)到平穩(wěn)，水解度為47.6%；水解8 h變化不大，水解度為50.8%。故在工業(yè)化生產(chǎn)中，只需酶解6 h即可達(dá)到合適的水解度。

2.2 粗洋蔥多肽分子量分布

合適分子量多肽的抗氧化性具有最好的效果，故有必要測定其分子量分布范圍。以標(biāo)品的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)、分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=5.61056-0.08286x，R2=0.99786，見圖2。

圖2 標(biāo)品分子量與保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of molecular weight and retention time of standard product

由圖2可知，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度較高，符合下一步要求，可利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線測定多肽樣品的分子量分布。對4種粗洋蔥多肽液相樣品圖進(jìn)行手動(dòng)積分，并且以分子量6 kDa(22.11 min)、3 kDa(25.74 min)、1 kDa(31.50 min)、0.1 kDa(43.57 min)為分界線，得到以下分子量分布結(jié)果，見表1。

表1 粗洋蔥多肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of crude onion peptides %

由表1可知，P-2水解度很低，幾乎有一半的蛋白質(zhì)在6 kDa以上，小于1 kDa的多肽僅僅占10%左右；隨著水解時(shí)間的延長，可以看出分子量明顯變小，P-6和P-8的小分子多肽的含量已經(jīng)很高。

2.3 洋蔥蛋白、粗洋蔥多肽氨基酸組分

氨基酸的種類和比例很大程度上決定了多肽或蛋白的性質(zhì)，包括其抗氧化性[13-15]。對洋蔥蛋白和4種粗洋蔥多肽的氨基酸組成進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。

表2 洋蔥蛋白、粗洋蔥多肽氨基酸組分Table 2 Amino acid composition of onion protein and crude onion peptides

由表2可知，洋蔥蛋白中谷氨酸含量較高，其他氨基酸的含量相當(dāng)。洋蔥蛋白酶解后，蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸等必需氨基酸含量有所上升，這提高了洋蔥蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，并且基本呈現(xiàn)出水解度越大提高越多的規(guī)律。根據(jù)文獻(xiàn)[15]，蛋氨酸和半胱氨酸在抗氧化方面具有特別的效果，二者分別能夠作為內(nèi)源抗氧化劑和抵抗X-射線輻射，粗洋蔥多肽中蛋氨酸和半胱氨酸顯著提高，故抗氧化性可能有所提高。

2.4 洋蔥多肽分離純化

用不同截留分子量的超濾膜分離粗洋蔥多肽，得到4種分子量組分，各組分質(zhì)量含量見表3。與分子量分布結(jié)果相似，隨著水解度的增大，P-I比例下降；P-II先下降再上升；P-III上升；P-IV上升。

表3 各樣品的DPPH·清除能力和洋蔥多肽純化結(jié)果Table 3 DPPH · scavenging capacity and onion peptides' purification results of each sample

續(xù) 表

2.5 DPPH·清除能力

洋蔥蛋白、粗洋蔥多肽、純化組分的DPPH·清除能力見表3。洋蔥蛋白的DPPH·清除能力為42.44%；對于粗洋蔥多肽，正如2.3部分的預(yù)測，隨著水解度的增大，DPPH·清除能力先急劇增強(qiáng)后趨于平穩(wěn)，最高能達(dá)到69.32%；對于純化組分，可觀察到P-III組分的DPPH·清除能力最強(qiáng)，這可能歸功于其合適的分子量(Mw=1～5 kDa)[16]。有研究報(bào)道，分子量小的組分比分子量過大的組分抗氧化性更強(qiáng)，我們的結(jié)果與之相符[17]。

3 結(jié)論

利用堿提酸沉法提取洋蔥蛋白，以木瓜蛋白酶酶解洋蔥蛋白，得到粗洋蔥多肽產(chǎn)物，酶解6 h，水解度基本達(dá)到最大值47.6%。與洋蔥蛋白相比，粗洋蔥多肽具有良好的DPPH·清除能力，并且與水解度成正比，最高能達(dá)到69.32%。將粗洋蔥多肽進(jìn)行膜超濾法分離純化，得到4個(gè)分子量組分，在4種水解度的粗洋蔥多肽中，P-III組分(Mw=1～5 kDa)的DPPH·清除能力均為最強(qiáng)，這歸功于其合適的分子量分布。由氨基酸組成測定結(jié)果可知，粗洋蔥多肽的必需氨基酸組分、支鏈氨基酸組分均有所提高，這很大程度上決定了DPPH·清除能力的提高。