蔣立新，葛青*，張強 ，章興，肖竹錢 ，毛建衛(wèi)，泮國榮

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室， 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023； 2.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州 313300)

釀造醬油是以植物蛋白和淀粉等為原料，在適宜的條件下經(jīng)過一段時間的發(fā)酵，從而生產(chǎn)出含有多種氨基酸、碳水化合物等有機物以及具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[1]。隨著社會不斷的發(fā)展進步，新型原料作為輔料釀造的醬油開始出現(xiàn)，如詹超群等[2]通過研究添加秘魯魷魚骨粉來釀造醬油，發(fā)現(xiàn)在醬油制曲過程中添加適量的魷魚骨粉，會促進醬油制曲過程中微生物的生長以及其酶系的分泌，并且會使醬油曲中的揮發(fā)性成分高達36.31%。而張昕等[3]研究發(fā)現(xiàn)紫蘇醬的調(diào)味、增香和保健功能更好。同時牟燦燦等[4]用薏仁碎米代替麩皮釀造醬油是可行的,且優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵醬油。

在傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的醬油中，無論是制曲還是發(fā)酵生產(chǎn)中，微生物起到了無法替代的作用，微生物含有多種酶系，其中米曲霉作為發(fā)酵醬油必不可少的菌種，其所分泌的蛋白酶和淀粉酶對醬油釀造過程中所產(chǎn)生的風(fēng)味和營養(yǎng)具有重要作用[5]。

制曲作為提高釀造醬油質(zhì)量的關(guān)鍵工序，直接影響釀造醬油的原料利用及品質(zhì)形成，這一過程主要由可分泌多種酶系的曲霉完成[6]。作為制曲的主要原料性質(zhì)(高蛋白含量)決定了制曲過程中酶活力的高低，進而決定了制曲的好壞。蛋白酶的主要作用是將原料中的大分子蛋白質(zhì)分子分解為小分子物質(zhì)如氨基酸、低分子肽、多肽和胨，進一步被微生物生長所利用；淀粉酶通過將輔料中的淀粉分解成可以被微生物吸收的小分子的葡萄糖、雙糖、三糖、糊精等[7]，這些被分解成小分子的氨基酸和糖類不僅易于被發(fā)酵過程中的微生物吸收，也是釀造醬油中非揮發(fā)性物質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體[8]，也為后階段其他微生物的生長創(chuàng)造了條件。

竹筍營養(yǎng)齊全，一直以來是許多學(xué)者研究的熱點，竹筍富含各種營養(yǎng)素[9]；并且食用竹筍中的蛋白含量高達其干重的30%[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)：食用竹筍中含有大量蛋白質(zhì)和豐富的呈味氨基酸，是一類極具開發(fā)潛力的蛋白質(zhì)資源。目前，我國竹筍的產(chǎn)品加工主要集中于咸菜筍、清水筍和筍干等。為緩解竹筍出筍期銷售的壓力，在產(chǎn)筍旺季時進行適合的加工，能提高筍產(chǎn)品的附加值，將會有很好的市場開發(fā)前景。基于這一狀況，本文研究了竹筍對發(fā)酵醬油的制曲工藝、活性成分和抗氧化性活性等的影響。本研究也首次將竹筍應(yīng)用于釀造醬油中，這不僅有望為傳統(tǒng)醬油提供一種新的醬油釀造思路，而且醬油中還有竹筍中的功能性成分，是一種全新的功能性醬油。

1 材料與方法

1.1 材料

食用竹筍、黃豆、食用麥麩、醬油曲精：市售；福林試劑、干酪素、L-酪氨酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸、乙酸鈉、甲醛、酒石酸鉀鈉、沒食子酸、蘆丁、3，5-二硝基水楊酸、苯酚：分析純；碘標準液；2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。

1.2 設(shè)備

HZT-B3002電子稱；PTX-FA210電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SPX-B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計 上海市元析儀器有限公司；Allegra X-12R型離心機 貝克曼庫爾特有限公司；DF-101S磁力加熱攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制曲

將大豆和竹筍用清水清洗3遍后，浸泡6～8 h。最后將泡好的大豆、竹筍和食用麥麩一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃，0.1 MPa條件下，滅菌30 min后取出，放置過夜。

在放置過夜的黃豆和竹筍中，拌入麥麩，攪拌均勻后加入醬油曲精，進行恒溫培養(yǎng)制曲。翻曲的目的是為了避免局部溫度過高從而導(dǎo)致的燒曲，使蛋白酶活力下降。最佳翻曲時間為在一定溫度下恒溫培養(yǎng)12 h，翻曲1次，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)12 h后再翻曲1次；然后培養(yǎng)48～72 h，直到制曲原料表面長滿黃綠色孢子即制曲成功。

1.3.2 醬醪發(fā)酵

采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵，添加竹筍制曲發(fā)酵的成品醬油為A，不加竹筍制曲發(fā)酵的成品醬油為B。將優(yōu)化好的曲料入罐發(fā)酵，添加濃度為20%的鹽水，每個樣品平行釀造3缸。培養(yǎng)發(fā)酵180 d。第1天15 ℃發(fā)酵，每天升溫1 ℃，達到30 ℃后，持續(xù)30 ℃發(fā)酵，發(fā)酵時間總計6個月[11]。

1.3.3 酶液的提取

向干燥的250 mL錐形瓶中加入成曲10.0 g左右，然后加入磷酸緩沖溶液80 mL (磷酸緩沖溶液pH 7.2)，混勻,40 ℃條件下磁力攪拌恒溫提取1 h，立即計時，取出后立即沸水浴5 min，通過高溫來破壞蛋白酶的活力，水浴過后自然冷卻至室溫。用4層紗布過濾定容至100 mL，得到粗酶液，離心后取上清液于4 ℃冰箱中待測。

1.3.4 相關(guān)酶活力的測定

參考GB 1886/174-2016制作酪氨酸標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.0105x-0.0007(R2=0.9996)。綜合酶活力的測定和淀粉酶活力的測定參考潘雁紅等[12]的方法,糖化酶活力和制作葡萄糖標準曲線，得到葡萄糖線性回歸方程：y=1.129x+0.0076(R2=0.9975)。

1.4 制曲工藝的單因素試驗

將放置過夜的大豆、竹筍、麥麩和醬油曲精按一定比例混合后，恒溫培養(yǎng)一定時間后，每隔一段時間取樣(本文以間隔時間為12 h)，通過測定其蛋白酶活力和其他相應(yīng)的酶活力來檢驗其制曲的結(jié)果，每個樣品做3個平行?？疾熘魄鷷r間(24，36，48，60，72 h)、制曲溫度(28，30，32，34，36 ℃)、醬油曲精添加量(0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)以及竹筍添加量(5%、10%、15%、20%、40%、60%、80%、100%)對制曲過程中酶活力的影響。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化制曲工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計及單因素試驗結(jié)果確定響應(yīng)面因素水平，利用Design Expert 7.11軟件，以制曲時間、制曲溫度、醬油曲精添加量、竹筍的添加量進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計(見表1)，考察4個因素之間的相互作用對制曲過程中酶活力的影響，優(yōu)化制取工藝的最佳配方。制曲的成功與失敗可以通過曲料的顏色和曲味等感官因素評定，選擇蛋白酶活力為其主要的評價指標。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.6 醬油成品中基本理化指標的測定

根據(jù)GB 18186-2000和參考邱露等[13]的方法并略作修改測定氨基酸態(tài)氮。利用全自動凱氏定氮儀測定總氮。根據(jù)GB 5009.7-2016，利用全自動還原糖測定儀(SGD-IV型)測定還原糖。

1.7 醬油成品中總酚、總黃酮以及抗氧化能力的測定

1.7.1 總酚的測定

參考張歡歡等[14]的方法，略有修改。分別移取1 mL各濃度的沒食子酸標準溶液和樣品于50 mL離心管中，加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，3 min后，加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，振蕩混勻，120 r/min 25 ℃避光震蕩反應(yīng)1 h。以沒食子酸空白為參比溶液，在波長為765 nm分光光度計下讀取吸光值，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。得到回歸方程為：y=0.0117x+0.0096(R2=0.999)。

1.7.2 總黃酮的測定

參考鄭有飛等[15]的方法，略有修改。取2 mL樣品于離心管中，用甲醇稀釋至6 mL，搖勻后取上層清液1 mL，加入30%乙醇溶液至5 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,混勻后放置6 min，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用30%乙醇溶液定容至10 mL，放置10 min，以零管為空白，在510 nm的波長處測定吸光度。以蘆丁為標品，按照上述方法測定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。得到回歸方程為：y=0.1368x+0.0083(R2=0.999)。

1.7.3 抗氧化能力的測定

1.7.3.1 還原力

參考李丹等[16]的方法，略作修改。將5,10,15,20,25 μL樣品加磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)至2.5 mL，然后加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀(W/V)，混合均勻，50 ℃下反應(yīng)30 min，再加入10%三氯乙酸(W/V) 2.5 mL，混合均勻，靜止 10 min，立即取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵(W/V)，混合均勻，以去離子水為參比溶液，在700 nm下測定。吸光度值越高，還原力越強。

1.7.3.2 ABTS自由基清除試驗

參考李瑩等[17]的方法，略有修改。取1 mL樣品，稀釋至50 mL，取50，100，150，200，250，300 μL分別用磷酸緩沖液(5 mmol/L，pH 7.4)補至300 μL，再加入5 mL上述稀釋液，在30 ℃下，反應(yīng)1 h。以去離子水為參比溶液，在734 nm下測定吸光度。

式中：A0為空白對照液的吸光度，即去離子水+ABTS自由基PBS溶液；A1為樣品測定管的吸光度，樣品+ABTS自由基PBS溶液；A2為樣品本底管的吸光度，樣品+PBS溶液。

1.8 統(tǒng)計分析

用Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 制曲時間的確定

制曲時間長短決定了微生物是否得到了充分的生長繁殖，如果制曲時間不足，則會導(dǎo)致微生物達不到最佳的生長效果，也不能夠達到對原料的充分利用，致使原料的浪費，其相應(yīng)的蛋白酶活力也會降低；相反，如果制曲時間過長，會導(dǎo)致其原料的消耗，使微生物在生長發(fā)育過程中受阻，同樣地其酶活力也會下降，達不到理想的結(jié)果，同時增加了原料的消耗。因此，以高蛋白酶活力為依據(jù)確定最佳制曲時間。制曲時間對酶活力的影響見圖1，在制曲溫度為30 ℃、醬油曲精用量為0.20%、竹筍添加量為5%的條件下，在單因素制曲過程中，蛋白酶活力、糖化酶活力和綜合酶活力隨著制曲時間的增加，呈現(xiàn)出的趨勢均為先增大后減小。當(dāng)制曲時間為60 h時，三者同時達到最大值，分別為669.10 U/g干基，640.14 U/g干基，0.44 U/100 g干基,因此選擇最佳的制曲時間為60 h。

圖1 制曲時間對酶活力的影響Fig.1 Effect of koji-making time on enzyme activity

2.1.2 制曲溫度的確定

溫度是微生物生長繁殖至關(guān)重要的因素，一般情況下，微生物的生長溫度在低于25 ℃時，其生長代謝都比較緩慢；當(dāng)其生長溫度高于38 ℃時，則非常不利于微生物的生長代謝，反而適合細菌的發(fā)育繁殖，并且易染雜菌，影響制曲[18]。選定制曲時間為60 h、接種量為0.2%、竹筍添加量為5%的條件下，考察制曲溫度對酶活力的影響。隨著制曲溫度的逐步升高，蛋白酶活力和糖化酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而淀粉酶活力和綜合酶活力則呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢，見圖2。

圖2 制曲溫度對酶活力的影響 Fig.2 Effect of koji-making temperature on enzyme activity

當(dāng)制曲溫度為30 ℃時，蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力和綜合酶活力同時達到最高。因此，選擇最佳的制曲溫度為30 ℃。

2.1.3 醬油曲精接種量的確定

醬油制曲的周期直接受醬油曲精接種量的影響。醬油曲精接種量大可以縮短制曲的周期，減少被雜菌污染的機率，但如果醬油曲精接種量過大，制曲過程中，其本來用于生長繁殖的主要營養(yǎng)物質(zhì)會被菌體細胞生長所利用，曲精生長時營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，從而導(dǎo)致其不能很好地生長繁殖，也會使其酶活力大大地降低，并且在菌體細胞生長利用營養(yǎng)物質(zhì)的同時會產(chǎn)生大量的代謝廢物，使微生物原所處的生長環(huán)境得到惡化，菌體細胞也會較早衰老，維持微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)也得不到滿足，就會形成大量休眠孢子，降低酶活力；倘若接種量過小，微生物生長繁殖不足，使得營養(yǎng)過剩，造成浪費，增加生產(chǎn)成本[19]。選定制曲時間為60 h、制曲溫度為30 ℃、竹筍添加量為5%的條件下，考察曲精量對成曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 醬油曲精用量對制曲過程中酶活力的影響Fig.3 Effect of the amount of soy sauce koji extract on the enzyme activity in the koji-making process

蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨接種曲精量的增加而增大，達到最大值時的曲精量為0.20%，隨著接種量的持續(xù)增加，酶活力呈逐漸減小趨勢。因此，控制接種曲精量為0.20%。

2.1.4 竹筍添加量的確定

竹筍高纖低脂，營養(yǎng)齊全，蛋白含量較高，在制曲過程中竹筍中的蛋白質(zhì)可被微生物所利用，提高蛋白酶活力，但同時由于竹筍中水分含量高，添加太多對微生物的生長不利，添加太少又達不到利用竹筍制曲的目的。因此選定在制曲時間為60 h、制曲溫度為30 ℃、醬油曲精用量為0.20%的條件下，考察竹筍的最佳添加量對成曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 竹筍占比對酶活力的影響Fig.4 Effect of bamboo shoots proportion on enzyme activity

由圖4可知，當(dāng)竹筍添加量為5%時，其蛋白酶活力最高為834.86 U/g干基。當(dāng)竹筍添加量增大時，其蛋白酶活力明顯下降，其下降幅度為24.20%；當(dāng)竹筍添加量繼續(xù)增加時，蛋白酶活力會繼續(xù)減小，減小幅度最大為64.53%。因此，選擇最佳的竹筍添加量為5%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

結(jié)合單因素試驗，以制曲時間(A)、制曲溫度(B)、醬油曲精用量(C)和竹筍占比(D)4個條件為自變量，蛋白酶活力為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計矩陣響應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Response data results of Box-Behnken design matrix

2.2.1 回歸方程的建立與顯著性分析

通過對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到蛋白酶活力對制曲時間、制曲溫度、醬油曲精用量和竹筍占比的回歸模型：

R=617.5260-28.89833A-22.04333B-5.35583C-45.84250D-18.42750AB+12.7225AC+73.1200AD+81.54000BC+44.39750BD+9.63000CD-75.32842A2-34.29842B2-79.21717C2-106.45217D2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

續(xù) 表

注：P<0.01表示差異高度顯著，用“**”表示；P<0.05表示差異顯著，用“*”表示。

由表3模型方差分析可知，回歸方程的各項系數(shù)顯著性，在制曲過程4個單因素中，對蛋白酶活力具有極顯著影響的是B(制曲溫度)，而對蛋白酶活力具有顯著性影響的為A(制曲時間)和C(醬油曲精接種量)。在各交互相中，制曲時間和制曲溫度之間的交互作用、制曲溫度和醬油曲精接種量之間的交互作用、制曲溫度和竹筍占比之間的交互作用對蛋白酶活力有極顯著性影響；醬油曲精接種量和竹筍占比之間的交互作用有顯著性影響；對于蛋白酶活力值各二次項均有顯著影響。

通過對表3中模型方程進行方差分析可知：采用F值對模型的顯著性進行分析，F(xiàn)值為22.85，P值<0.0001，該結(jié)果顯示所選取的模型合適，R2(模型確定系數(shù))=0.9528，表明有95.28%的變化可以用該模型所解釋。表明該模型對試驗的擬合程度良好，進一步說明該模型對優(yōu)化制曲條件的試驗很合適[20]，因此在預(yù)測和分析釀造醬油制曲過程中蛋白酶活力變化值時，該模型是可以使用的。模型值為22.85，P值<0.0001，具有高度顯著性；模型調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.9161，表明此回歸模型與實測值擬合較好，可用于制曲過程中蛋白酶活力的預(yù)測及分析。

2.2.2 響應(yīng)面分析

在研究制曲過程中交互項對蛋白酶活力的影響時，在其他因素不變的情況下，任意選擇2個因素觀察其對蛋白酶活力的影響，對表2的數(shù)據(jù)進行擬合，即可得到等高線圖和響應(yīng)面圖。制曲時間(A)和制曲溫度(B)之間的交互作用(見圖5)、制曲溫度(B)和接種量(C)之間的交互作用(見圖6)、制曲溫度(B)和竹筍占比(D)之間的交互作用(見圖7)對制曲過程中蛋白酶活力具有顯著的影響，這一結(jié)果與回歸方程的交互項顯著性分析結(jié)果相符。

可通過響應(yīng)曲面的響應(yīng)圖對蛋白酶活力產(chǎn)生兩兩交互影響的試驗因素進行評價，進而確定各因素的最佳水平范圍，響應(yīng)曲面頂點附近的區(qū)域即為最佳水平范圍。如果響應(yīng)值的大小對于影響因素的改變不是很靈敏，那么該響應(yīng)面相對應(yīng)的曲面的坡度應(yīng)較為平緩，相反，若響應(yīng)值對于影響因素的改變較敏感，那么該響應(yīng)面相對應(yīng)的曲面的坡度應(yīng)較為陡峭。同時也可以用等高線的形狀來說明交互作用對響應(yīng)值影響的強弱，一般情況下兩因素交互作用顯著，則其形狀接近橢圓形，若交互作用不顯著則為圓形。根據(jù)回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖5～圖7。

圖5 制曲時間和制曲溫度之間交互作用的 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour maps of the interaction between koji-making time and koji-making temperature

圖6 制曲溫度和接種量之間交互作用的 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour maps of the interaction between koji-making temperature and inoculum amount

圖7 制曲溫度和竹筍占比之間交互作用的 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour maps of the interaction between koji-making temperature and bamboo shoots proportion

2.3 模型的檢驗

通過采用蛋白酶活力最大響應(yīng)值相對應(yīng)的響應(yīng)因素值來進行檢驗預(yù)測值與真實值之間的擬合程度以及方程的合適性、有效性，制曲時間62.5 h，制曲溫度31.5 ℃，曲精用量0.23%，竹筍占比6.50%為最佳制曲工藝條件，經(jīng)過3組平行試驗，得到其蛋白酶活力658.35 U/g干基，預(yù)計值為660.96 U/g干基，與計算值誤差<0.39%，說明該模型能良好預(yù)測實際情況。

2.4 醬油發(fā)酵過程中總氮和氨基酸態(tài)氮的變化

圖8 醬油發(fā)酵過程中總氮和氨基酸態(tài)氮的變化Fig.8 Changes of total nitrogen and amino acid nitrogen in soy sauce during fermentation

醬油在發(fā)酵的同時也進行著復(fù)雜的生化反應(yīng)，醬油的品質(zhì)受這些反應(yīng)產(chǎn)物的影響。由圖8可知，竹筍制醬油的總氮和氨基酸態(tài)氮與傳統(tǒng)醬油的變化趨勢相同，均為在5～30 d內(nèi)顯著增加，之后趨于緩慢增加。試驗過程中總氮增加的原因主要是原料蛋白質(zhì)不斷被蛋白酶水解成可溶性的肽類及氨基酸成分[21]；醬油A和B總氮含量和氨基酸態(tài)氮含量在后2個月的增長速度相同，但A中的總氮與氨酸基態(tài)氮含量高于B，氨基酸態(tài)氮是原料蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，由于醬油A中蛋白質(zhì)越高，蛋白酶活力越高，其可溶出氮含量就越高。

2.5 總酚和總黃酮含量變化

圖9 發(fā)酵過程中醬油總酚和總黃酮含量含量的變化Fig.9 Changes of total phenolics and flavonoids content in soy sauce during fermentation

多酚類化合物之所以被稱為高效的天然氧化物，是因為多酚類化合物中含有多酚羥基，而多酚羥基又具有較強的抗氧化能力以及清除自由基的能力[22],主要包括酚酸、黃酮和單寧類物質(zhì)等。由圖9可知，在整個發(fā)酵階段，前30 d A類醬油和B類醬油中總酚含量迅速增加，在后5個月的發(fā)酵過程中，B類醬油呈現(xiàn)緩慢持續(xù)增長的趨勢，而A類醬油則在第2個月增長速度遠大于之后4個月的增加速度。竹筍中含有多酚類物質(zhì)，在發(fā)酵過程中，通過微生物作用，溶進醬油中，說明添加竹筍制曲發(fā)酵的醬油高于傳統(tǒng)發(fā)酵醬油。另外，醬油中酪氨酸含酚羥基，福林酚法測得的醬油總酚含量稍有偏高。總黃酮一直處于穩(wěn)定增加的趨勢，A類醬油比B類醬油中總黃酮含量高，可能是由于添加了竹筍的原因，另外蛋白酶也起到了主導(dǎo)作用，酶活力高，對原料的分解越多，則能夠使原料中的黃酮類物質(zhì)更好地溶解于醬油中。

2.6 發(fā)酵過程中醬油抗氧化活性的變化

采用還原力、ABTS法體外抗氧化方法來評價醬油的抗氧化活性，見圖10。

由圖10可知，成品醬油A和B的抗氧化活性隨發(fā)酵時間延長而顯著上升，主要是因為在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的不斷進行，原料中酚類、多肽類等活性物質(zhì)不斷溶出，美拉德產(chǎn)物、呋喃酮等活性物質(zhì)也不斷生成。在2種抗氧化指標中，還原力和ABTS在整個發(fā)酵過程中A類成品醬油抗氧化活性一直高于B類醬油，造成該現(xiàn)象的主要原因為醬油中對不同抗氧化評價方法相應(yīng)的抗氧化活性物質(zhì)不同。該研究結(jié)果與劉靜怡等[23]的研究結(jié)果類似。

圖10 發(fā)酵過程中醬油抗氧化活性的變化Fig.10 Changes of antioxidant activity of soy sauce during fermentation

3 結(jié)果與討論

在本試驗制曲過程中，制曲因素(制曲時間、制曲溫度、曲精量和竹筍添加量)對制曲過程中蛋白酶活力均有顯著影響，制曲因素中影響蛋白酶活力的順序為制曲溫度>制曲時間>曲精量>竹筍添加量，而且各因素存在一定的交互作用。

以醬油曲精為發(fā)酵菌種，在單因素的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法研究了釀造醬油制曲過程中添加竹筍的最優(yōu)制曲工藝條件為制曲時間62.5 h，制曲溫度31.50 ℃，接種曲精量0.23%，竹筍占比6.50%，在此條件下蛋白酶活力最高可達658.35 U/g干基。

在制曲的最優(yōu)條件下，采用高鹽稀態(tài)工藝釀造竹筍醬油，研究發(fā)現(xiàn)竹筍添加能不同程度地提高醬油總氮、氨基酸態(tài)氮、總酚、總黃酮含量，其增加百分比分別為9.24%、15.96%、4.55%、3.83%。經(jīng)體外抗氧化評價方法證實，與傳統(tǒng)醬油相比，竹筍醬油抗氧化活性隨著發(fā)酵時間延長不斷上升。在成品竹筍醬油中其還原力和ABTS清除自由基能力提高百分比分別為10.08%和11.63%。 因此，在高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中，竹筍可部分替代黃豆，作為功能性更強的新型醬油，該研究為新產(chǎn)品醬油的研發(fā)提供了一定的理論支持。