李楊，陳宇航,，劉雪薇，裴曉方*

(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院，成都 610041； 2.食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 3.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336)

水豆豉作為傳統(tǒng)黃豆發(fā)酵食品，深受西南地區(qū)人民喜愛。微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酶而使黃豆中的原料發(fā)生水解，形成了水豆豉特有的風(fēng)味。水豆豉富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并有潛在的預(yù)防胃損傷和抗氧化等功能[1]。發(fā)酵過(guò)程中有大量諸如豆豉纖溶酶、抗氧化劑等代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[2]，豐富食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是，我國(guó)水豆豉的生產(chǎn)仍以自然發(fā)酵為主。在自然發(fā)酵過(guò)程中，不同生產(chǎn)來(lái)源的水豆豉容易受發(fā)酵溫度、時(shí)間、微生物這些環(huán)境因素的影響，無(wú)法保障水豆豉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及食用安全。本課題組前期從水豆豉中分離得到一株高產(chǎn)豆豉纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌，若能將其接種黃豆進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，將會(huì)大大提高水豆豉的發(fā)酵品質(zhì)。

水豆豉的發(fā)酵步驟可分為：浸泡、瀝水、蒸煮、冷卻、前發(fā)酵、加輔料及后發(fā)酵階段。由于后發(fā)酵階段涉及佐料的加入以及發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本研究主要優(yōu)化前發(fā)酵階段的環(huán)境參數(shù)。發(fā)酵過(guò)程中影響水豆豉品質(zhì)的環(huán)境參數(shù)有很多，最常納入優(yōu)化的發(fā)酵條件有發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和菌株接種量[3-5]。本研究首先通過(guò)單因素法控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和菌株接種量，縮小發(fā)酵條件范圍，再根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化得出水豆豉的最優(yōu)發(fā)酵條件，比較發(fā)酵優(yōu)化水豆豉與市售水豆豉之間的差異，為貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵水豆豉提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一等黃豆：成都人民營(yíng)養(yǎng)食品廠；貝萊斯芽孢桿菌：本課題組分離純化；LB肉湯：北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；市售水豆豉：貴州某品牌；纖維蛋白原F3879-250 mg、凝血酶T4648-1 kU：Sigma公司；尿激酶 U108373-10 mg：Aladdin公司；瓊脂糖：TQINGKE公司；鹽酸：北京化工廠；無(wú)水碳酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；酚酞、乙醇、甲醛：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

PICO21、FRESCO21離心機(jī) Thermo公司；SQP千分之一、萬(wàn)分之一電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水豆豉發(fā)酵步驟

稱取30 g黃豆，加入3倍浸泡水量的超純水，浸泡12 h。瀝干后高壓蒸汽滅菌30 min，待自然冷卻接入菌液搖勻，恒溫培養(yǎng)，1～5 d后收獲水豆豉。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，即黃豆經(jīng)高壓滅菌后不接種菌液，其余發(fā)酵步驟相同。

1.3.2 水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)

針對(duì)水豆豉發(fā)酵優(yōu)化方向，檢測(cè)指標(biāo)包括感官指標(biāo)和理化指標(biāo)。

1.3.2.1 感官指標(biāo)[6]

感官指標(biāo)分為形態(tài)、粘液、拉絲、氣味、口感5個(gè)部分，由實(shí)驗(yàn)人員組成評(píng)價(jià)小組，獨(dú)立判斷后打分，取平均值作為最終結(jié)果。

表1 水豆豉感官評(píng)分表Table 1 Sensory evaluation standard of fermented soya beans

注：拉絲長(zhǎng)度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)是將水豆豉攪拌2 min后，用槍頭挑起，以10 cm為1個(gè)單位從中間挑起，垂直拉10 cm為2個(gè)單位，再?gòu)睦鸬?0 cm中挑起，重復(fù)進(jìn)行，直到拉絲斷裂，記錄拉絲單位。

1.3.2.2 理化指標(biāo)

理化指標(biāo)包括氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖、pH值和豆豉纖溶酶活性，參照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》、GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》、GB 5009.237-2016《食品中pH值的測(cè)定》的方法[7-9]，采用化學(xué)法測(cè)定水豆豉中的氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖含量，采用pH計(jì)檢測(cè)水豆豉中的pH值，采用纖維蛋白平板法檢測(cè)水豆豉中的豆豉纖溶酶活性[10]。

1.3.3 單因素法發(fā)酵試驗(yàn)

選取不同發(fā)酵時(shí)間(1，2，3，4，5 d)、不同發(fā)酵溫度(25，30，35，40，45 ℃)和不同接菌量(0.01%、0.1%、1%、5%、10%)3個(gè)因素做單因素法發(fā)酵試驗(yàn)，以水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)縮小最佳發(fā)酵條件范圍。

1.3.4 響應(yīng)面法發(fā)酵試驗(yàn)

在單因素發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件，以水豆豉中氨基酸態(tài)氮含量(Y1)和豆豉纖溶酶活性(Y2)為響應(yīng)指標(biāo)，以Box-Behnken模型按照三因素三水平設(shè)計(jì)獲得17種發(fā)酵條件，包括13個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和4個(gè)檢驗(yàn)誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)。按1.3.1發(fā)酵步驟進(jìn)行試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.5 最優(yōu)發(fā)酵條件水豆豉品質(zhì)檢測(cè)

參照1.3.2.2的方法，將最優(yōu)發(fā)酵條件的水豆豉與市售的水豆豉進(jìn)行比較，以未加菌發(fā)酵的黃豆作為陰性對(duì)照，檢測(cè)理化指標(biāo)包括氨基酸態(tài)氮、總酸、pH值、還原糖含量和豆豉纖溶酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素法發(fā)酵試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響

不同發(fā)酵時(shí)間下，水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖1。

由圖1可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加?？偹岷吭?～2 d增加，在3～5 d下降。還原糖含量在0～3 d基本保持穩(wěn)定，3～4 d上升，4～5 d下降。pH值在發(fā)酵5 d內(nèi)變化較小，酸堿度從弱酸性變?yōu)橹行?。豆豉纖溶酶活性在0～4 d內(nèi)都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在3 d達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性略有下降。感官評(píng)價(jià)差異較小，在41～63分范圍內(nèi)。因?yàn)榘被釕B(tài)氮含量、還原糖含量、豆豉纖溶酶活性為越高越好，總酸含量為越低越好，綜合考慮，將發(fā)酵時(shí)間限定在3～5 d。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響

不同發(fā)酵溫度下，水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖2。

由圖2可知，氨基酸態(tài)氮含量在25～40 ℃范圍內(nèi)逐漸上升，在40～45 ℃范圍內(nèi)開始下降。總酸含量波動(dòng)較大，25～35 ℃范圍內(nèi)總酸含量高于30～45 ℃。還原糖含量也呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，先增加后降低再上升。pH值在發(fā)酵5 d內(nèi)變化較小。豆豉纖溶酶在25～40 ℃范圍內(nèi)，活性先降低后升高，45 ℃時(shí)未檢測(cè)到酶活性。感官評(píng)價(jià)指標(biāo)變化較小，在40～65分范圍內(nèi)。綜合考慮，將發(fā)酵溫度范圍限定在35～40 ℃。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.3 接菌量變化對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響

不同接菌量下，水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖3。

圖3 不同接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the detection indicators of fermented soya beans

由圖3可知，接菌量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量、總酸含量、還原糖含量及pH值的影響均較小。豆豉纖溶酶活性變化較大，0.01%～1%范圍內(nèi)活性下降明顯，1%～10%范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化依舊不明顯，在42～45分范圍內(nèi)?？紤]不同接菌量下氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸、pH值變化較小，以豆豉纖溶酶活性變化為主，將接菌量限定在0.01%～0.1%范圍內(nèi)。

2.2 響應(yīng)面法發(fā)酵試驗(yàn)

單因素發(fā)酵試驗(yàn)縮小的最佳發(fā)酵條件范圍為發(fā)酵時(shí)間3～5 d，發(fā)酵溫度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根據(jù)該條件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果見表3。

表2 試驗(yàn)因素編碼及水平表Table 2 The factors and levels of experiment

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)Table 3 Response surface design and responses

2.2.1 回歸模型建立及方差分析

應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程預(yù)測(cè)模型：

Y1=5.83×10-5-2.47×10-5×A+1.94×10-3×B-5.91×10-6×C。

Y2=2594.70-55.88A-415.30B+7970.77C-10.73AB-182.17AC-1467.06BC+0.96A2+107.93B2+36394.11C2。

方差分析驗(yàn)證模型及各參數(shù)的顯著性見表4和表5。

表4 氨基酸態(tài)氮回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of amino acid nitrogen

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

表5 豆豉纖溶酶回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model of fibrinolytic enzyme

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

兩者模型的P<0.05，表示可用該模型分析。失擬項(xiàng)的P>0.05，表示擬合較好，可用其替代真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表4和表5可知，氨基酸態(tài)氮的響應(yīng)值與溫度、接種量關(guān)系較小，與時(shí)間關(guān)系較大。而豆豉纖溶酶的響應(yīng)值與溫度、時(shí)間、接種量、時(shí)間×接種量、時(shí)間×?xí)r間、接種量×接種量顯著相關(guān)，由F值可以看出，以豆豉纖溶酶酶活為響應(yīng)值影響水豆豉發(fā)酵的因素從大到小依次為：發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>接種量。

2.2.2 響應(yīng)面分析

水豆豉各發(fā)酵條件對(duì)豆豉纖溶酶活性的影響見圖4～圖6。

圖4 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度交互作用 對(duì)豆豉纖溶酶活性的響應(yīng)面曲線Fig.4 Response surface plot of interaction between fermentation time and fermentation temperature to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為接種量0.1%。

由圖4可知，發(fā)酵溫度較發(fā)酵時(shí)間坡度更為陡峭，發(fā)酵溫度的影響大于發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵溫度與接種量交互作用對(duì)豆豉纖溶酶 活性的響應(yīng)面曲線Fig.5 Response surface plot interaction between fermentation temperature and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為發(fā)酵時(shí)間5 d。

由圖5可知，發(fā)酵溫度與接菌量的交互作用不明顯。

圖6 發(fā)酵時(shí)間與接種量交互作用對(duì)豆豉纖溶酶 活性的響應(yīng)面曲線Fig.6 Response surface plot interaction between fermentation time and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為發(fā)酵溫度35 ℃。

由圖6可知，等高線為橢圓形，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間與接種量的交互作用顯著。

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面法建立回歸模型并進(jìn)行優(yōu)化分析后，最終確定的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間5 d，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量0.01%。按照理論最佳發(fā)酵條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，在此條件下測(cè)得的氨基酸態(tài)氮模型計(jì)算值與實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)品的含量接近，豆豉纖溶酶的試驗(yàn)實(shí)際值略低于理論模型計(jì)算值。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 6 Verification experiment

2.3 最優(yōu)發(fā)酵條件水豆豉品質(zhì)檢測(cè)

陰性對(duì)照、最優(yōu)條件發(fā)酵水豆豉與市售水豆豉的氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性檢測(cè)結(jié)果見表7。

表7 氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸、pH值、 豆豉纖溶酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 7 Detection results of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid, pH and fibrinolytic enzyme activity

注：ND表示未檢出。

由表7可知，與陰性對(duì)照相比，最優(yōu)發(fā)酵水豆豉中的氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性均有明顯上升，可見水豆豉發(fā)酵過(guò)程中，微生物作用明顯，提高了蛋白質(zhì)的消化率，也產(chǎn)生了有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的豆豉纖溶酶。最優(yōu)條件發(fā)酵水豆豉的豆豉纖溶酶活性約為市售水豆豉的400倍，但是氨基酸態(tài)氮含量和還原糖含量仍較低，提示水豆豉的發(fā)酵仍不夠充分。

3 結(jié)論

用貝萊斯芽孢桿菌接種黃豆發(fā)酵水豆豉，經(jīng)單因素法發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)五水平的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接菌量進(jìn)行測(cè)定后，將發(fā)酵條件范圍縮小至發(fā)酵時(shí)間3～5 d，發(fā)酵溫度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根據(jù)響應(yīng)面法Box-Behnken模型按照三因素三水平設(shè)計(jì)獲得17種發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)優(yōu)化分析后最終確定的最優(yōu)發(fā)酵條件為：時(shí)間5 d，溫度35 ℃，接種量0.01%。最終發(fā)酵產(chǎn)物初步符合提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求，但在發(fā)酵程度上仍有一定的改進(jìn)空間。