李楊,陳宇航,,劉雪薇,裴曉方*
(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院,成都 610041; 2.食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041; 3.上海市疾病預(yù)防控制中心,上海 200336)
水豆豉作為傳統(tǒng)黃豆發(fā)酵食品,深受西南地區(qū)人民喜愛。微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酶而使黃豆中的原料發(fā)生水解,形成了水豆豉特有的風(fēng)味。水豆豉富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并有潛在的預(yù)防胃損傷和抗氧化等功能[1]。發(fā)酵過(guò)程中有大量諸如豆豉纖溶酶、抗氧化劑等代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[2],豐富食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是,我國(guó)水豆豉的生產(chǎn)仍以自然發(fā)酵為主。在自然發(fā)酵過(guò)程中,不同生產(chǎn)來(lái)源的水豆豉容易受發(fā)酵溫度、時(shí)間、微生物這些環(huán)境因素的影響,無(wú)法保障水豆豉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及食用安全。本課題組前期從水豆豉中分離得到一株高產(chǎn)豆豉纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌,若能將其接種黃豆進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化,將會(huì)大大提高水豆豉的發(fā)酵品質(zhì)。
水豆豉的發(fā)酵步驟可分為:浸泡、瀝水、蒸煮、冷卻、前發(fā)酵、加輔料及后發(fā)酵階段。由于后發(fā)酵階段涉及佐料的加入以及發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),本研究主要優(yōu)化前發(fā)酵階段的環(huán)境參數(shù)。發(fā)酵過(guò)程中影響水豆豉品質(zhì)的環(huán)境參數(shù)有很多,最常納入優(yōu)化的發(fā)酵條件有發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和菌株接種量[3-5]。本研究首先通過(guò)單因素法控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和菌株接種量,縮小發(fā)酵條件范圍,再根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化得出水豆豉的最優(yōu)發(fā)酵條件,比較發(fā)酵優(yōu)化水豆豉與市售水豆豉之間的差異,為貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵水豆豉提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)。
一等黃豆:成都人民營(yíng)養(yǎng)食品廠;貝萊斯芽孢桿菌:本課題組分離純化;LB肉湯:北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;市售水豆豉:貴州某品牌;纖維蛋白原F3879-250 mg、凝血酶T4648-1 kU:Sigma公司;尿激酶 U108373-10 mg:Aladdin公司;瓊脂糖:TQINGKE公司;鹽酸:北京化工廠;無(wú)水碳酸鈉:天津博迪化工股份有限公司;磷酸氫二鈉、四硼酸鈉:天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;酚酞、乙醇、甲醛:成都市科龍化工試劑廠;氫氧化鈉:天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。
PICO21、FRESCO21離心機(jī) Thermo公司;SQP千分之一、萬(wàn)分之一電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。
1.3.1 水豆豉發(fā)酵步驟
稱取30 g黃豆,加入3倍浸泡水量的超純水,浸泡12 h。瀝干后高壓蒸汽滅菌30 min,待自然冷卻接入菌液搖勻,恒溫培養(yǎng),1~5 d后收獲水豆豉。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照,即黃豆經(jīng)高壓滅菌后不接種菌液,其余發(fā)酵步驟相同。
1.3.2 水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)
針對(duì)水豆豉發(fā)酵優(yōu)化方向,檢測(cè)指標(biāo)包括感官指標(biāo)和理化指標(biāo)。
1.3.2.1 感官指標(biāo)[6]
感官指標(biāo)分為形態(tài)、粘液、拉絲、氣味、口感5個(gè)部分,由實(shí)驗(yàn)人員組成評(píng)價(jià)小組,獨(dú)立判斷后打分,取平均值作為最終結(jié)果。
表1 水豆豉感官評(píng)分表Table 1 Sensory evaluation standard of fermented soya beans
注:拉絲長(zhǎng)度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)是將水豆豉攪拌2 min后,用槍頭挑起,以10 cm為1個(gè)單位從中間挑起,垂直拉10 cm為2個(gè)單位,再?gòu)睦鸬?0 cm中挑起,重復(fù)進(jìn)行,直到拉絲斷裂,記錄拉絲單位。
1.3.2.2 理化指標(biāo)
理化指標(biāo)包括氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖、pH值和豆豉纖溶酶活性,參照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》、GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》、GB 5009.237-2016《食品中pH值的測(cè)定》的方法[7-9],采用化學(xué)法測(cè)定水豆豉中的氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖含量,采用pH計(jì)檢測(cè)水豆豉中的pH值,采用纖維蛋白平板法檢測(cè)水豆豉中的豆豉纖溶酶活性[10]。
1.3.3 單因素法發(fā)酵試驗(yàn)
選取不同發(fā)酵時(shí)間(1,2,3,4,5 d)、不同發(fā)酵溫度(25,30,35,40,45 ℃)和不同接菌量(0.01%、0.1%、1%、5%、10%)3個(gè)因素做單因素法發(fā)酵試驗(yàn),以水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)縮小最佳發(fā)酵條件范圍。
1.3.4 響應(yīng)面法發(fā)酵試驗(yàn)
在單因素發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件,以水豆豉中氨基酸態(tài)氮含量(Y1)和豆豉纖溶酶活性(Y2)為響應(yīng)指標(biāo),以Box-Behnken模型按照三因素三水平設(shè)計(jì)獲得17種發(fā)酵條件,包括13個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和4個(gè)檢驗(yàn)誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)。按1.3.1發(fā)酵步驟進(jìn)行試驗(yàn),確定最優(yōu)發(fā)酵條件。
1.3.5 最優(yōu)發(fā)酵條件水豆豉品質(zhì)檢測(cè)
參照1.3.2.2的方法,將最優(yōu)發(fā)酵條件的水豆豉與市售的水豆豉進(jìn)行比較,以未加菌發(fā)酵的黃豆作為陰性對(duì)照,檢測(cè)理化指標(biāo)包括氨基酸態(tài)氮、總酸、pH值、還原糖含量和豆豉纖溶酶活性。
2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響
不同發(fā)酵時(shí)間下,水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖1。
由圖1可知,氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加??偹岷吭?~2 d增加,在3~5 d下降。還原糖含量在0~3 d基本保持穩(wěn)定,3~4 d上升,4~5 d下降。pH值在發(fā)酵5 d內(nèi)變化較小,酸堿度從弱酸性變?yōu)橹行?。豆豉纖溶酶活性在0~4 d內(nèi)都呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在3 d達(dá)到最大,之后隨著時(shí)間延長(zhǎng),酶活性略有下降。感官評(píng)價(jià)差異較小,在41~63分范圍內(nèi)。因?yàn)榘被釕B(tài)氮含量、還原糖含量、豆豉纖溶酶活性為越高越好,總酸含量為越低越好,綜合考慮,將發(fā)酵時(shí)間限定在3~5 d。
圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the detection indicators of fermented soya beans
2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響
不同發(fā)酵溫度下,水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖2。
由圖2可知,氨基酸態(tài)氮含量在25~40 ℃范圍內(nèi)逐漸上升,在40~45 ℃范圍內(nèi)開始下降。總酸含量波動(dòng)較大,25~35 ℃范圍內(nèi)總酸含量高于30~45 ℃。還原糖含量也呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài),先增加后降低再上升。pH值在發(fā)酵5 d內(nèi)變化較小。豆豉纖溶酶在25~40 ℃范圍內(nèi),活性先降低后升高,45 ℃時(shí)未檢測(cè)到酶活性。感官評(píng)價(jià)指標(biāo)變化較小,在40~65分范圍內(nèi)。綜合考慮,將發(fā)酵溫度范圍限定在35~40 ℃。
圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the detection indicators of fermented soya beans
2.1.3 接菌量變化對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響
不同接菌量下,水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)變化見圖3。
圖3 不同接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the detection indicators of fermented soya beans
由圖3可知,接菌量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量、總酸含量、還原糖含量及pH值的影響均較小。豆豉纖溶酶活性變化較大,0.01%~1%范圍內(nèi)活性下降明顯,1%~10%范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化依舊不明顯,在42~45分范圍內(nèi)??紤]不同接菌量下氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸、pH值變化較小,以豆豉纖溶酶活性變化為主,將接菌量限定在0.01%~0.1%范圍內(nèi)。
單因素發(fā)酵試驗(yàn)縮小的最佳發(fā)酵條件范圍為發(fā)酵時(shí)間3~5 d,發(fā)酵溫度35~40 ℃,接菌量0.01%~0.1%。根據(jù)該條件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素水平見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果見表3。
表2 試驗(yàn)因素編碼及水平表Table 2 The factors and levels of experiment
表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)Table 3 Response surface design and responses
2.2.1 回歸模型建立及方差分析
應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到回歸方程預(yù)測(cè)模型:
Y1=5.83×10-5-2.47×10-5×A+1.94×10-3×B-5.91×10-6×C。
Y2=2594.70-55.88A-415.30B+7970.77C-10.73AB-182.17AC-1467.06BC+0.96A2+107.93B2+36394.11C2。
方差分析驗(yàn)證模型及各參數(shù)的顯著性見表4和表5。
表4 氨基酸態(tài)氮回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of amino acid nitrogen
注:“*”表示P<0.05;“**”表示P<0.01。
表5 豆豉纖溶酶回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model of fibrinolytic enzyme
注:“*”表示P<0.05;“**”表示P<0.01。
兩者模型的P<0.05,表示可用該模型分析。失擬項(xiàng)的P>0.05,表示擬合較好,可用其替代真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表4和表5可知,氨基酸態(tài)氮的響應(yīng)值與溫度、接種量關(guān)系較小,與時(shí)間關(guān)系較大。而豆豉纖溶酶的響應(yīng)值與溫度、時(shí)間、接種量、時(shí)間×接種量、時(shí)間×?xí)r間、接種量×接種量顯著相關(guān),由F值可以看出,以豆豉纖溶酶酶活為響應(yīng)值影響水豆豉發(fā)酵的因素從大到小依次為:發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>接種量。
2.2.2 響應(yīng)面分析
水豆豉各發(fā)酵條件對(duì)豆豉纖溶酶活性的影響見圖4~圖6。
圖4 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度交互作用 對(duì)豆豉纖溶酶活性的響應(yīng)面曲線Fig.4 Response surface plot of interaction between fermentation time and fermentation temperature to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans
注:固定水平為接種量0.1%。
由圖4可知,發(fā)酵溫度較發(fā)酵時(shí)間坡度更為陡峭,發(fā)酵溫度的影響大于發(fā)酵時(shí)間。
圖5 發(fā)酵溫度與接種量交互作用對(duì)豆豉纖溶酶 活性的響應(yīng)面曲線Fig.5 Response surface plot interaction between fermentation temperature and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans
注:固定水平為發(fā)酵時(shí)間5 d。
由圖5可知,發(fā)酵溫度與接菌量的交互作用不明顯。
圖6 發(fā)酵時(shí)間與接種量交互作用對(duì)豆豉纖溶酶 活性的響應(yīng)面曲線Fig.6 Response surface plot interaction between fermentation time and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans
注:固定水平為發(fā)酵溫度35 ℃。
由圖6可知,等高線為橢圓形,說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間與接種量的交互作用顯著。
2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)
通過(guò)響應(yīng)面法建立回歸模型并進(jìn)行優(yōu)化分析后,最終確定的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間5 d,發(fā)酵溫度35 ℃,接種量0.01%。按照理論最佳發(fā)酵條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),在此條件下測(cè)得的氨基酸態(tài)氮模型計(jì)算值與實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)品的含量接近,豆豉纖溶酶的試驗(yàn)實(shí)際值略低于理論模型計(jì)算值。
表6 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 6 Verification experiment
陰性對(duì)照、最優(yōu)條件發(fā)酵水豆豉與市售水豆豉的氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性檢測(cè)結(jié)果見表7。
表7 氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸、pH值、 豆豉纖溶酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 7 Detection results of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid, pH and fibrinolytic enzyme activity
注:ND表示未檢出。
由表7可知,與陰性對(duì)照相比,最優(yōu)發(fā)酵水豆豉中的氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性均有明顯上升,可見水豆豉發(fā)酵過(guò)程中,微生物作用明顯,提高了蛋白質(zhì)的消化率,也產(chǎn)生了有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的豆豉纖溶酶。最優(yōu)條件發(fā)酵水豆豉的豆豉纖溶酶活性約為市售水豆豉的400倍,但是氨基酸態(tài)氮含量和還原糖含量仍較低,提示水豆豉的發(fā)酵仍不夠充分。
用貝萊斯芽孢桿菌接種黃豆發(fā)酵水豆豉,經(jīng)單因素法發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)五水平的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接菌量進(jìn)行測(cè)定后,將發(fā)酵條件范圍縮小至發(fā)酵時(shí)間3~5 d,發(fā)酵溫度35~40 ℃,接菌量0.01%~0.1%。根據(jù)響應(yīng)面法Box-Behnken模型按照三因素三水平設(shè)計(jì)獲得17種發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn),經(jīng)優(yōu)化分析后最終確定的最優(yōu)發(fā)酵條件為:時(shí)間5 d,溫度35 ℃,接種量0.01%。最終發(fā)酵產(chǎn)物初步符合提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求,但在發(fā)酵程度上仍有一定的改進(jìn)空間。