肖 程 康 權(quán) 羅 慶

膽汁淤積性肝病是人類死亡的重要原因之一，慢性膽石癥、膽汁淤積性肝炎等均可發(fā)展為膽汁淤積性肝硬化。膽汁淤積性肝硬化是以膽管增生、肝細(xì)胞壞死、肝臟纖維化為特征的病理過程，目前其發(fā)生機(jī)制不完全清楚，且治療方法有限[1,2]。膽總管結(jié)扎術(shù)因與人類發(fā)生膽汁淤積性肝硬化的機(jī)制具有一定的相似性，故可被認(rèn)為是一種相對穩(wěn)定、有效的構(gòu)建動(dòng)物模型的經(jīng)典方法，在研究其病因、發(fā)病機(jī)制、治療手段中發(fā)揮重要作用[3,4]。本文詳述了balb/c小鼠經(jīng)腹中線小切口行膽總管結(jié)扎手術(shù)誘導(dǎo)膽汁淤積性肝硬化的過程，并對該模型進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)該方法具有切口小、手術(shù)時(shí)間短、對胃腸道功能干擾小、存活率高、重復(fù)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，是探索膽汁淤積性肝硬化病因、機(jī)制及治療的理想模型。

材料與方法

一、主要材料

頭戴式顯微鏡(德國Leica)， 6-0可吸收縫線(上海金環(huán))，戊巴比妥鈉(北京Notlas)，山羊血清(武漢博士德)，蘇木素、伊紅(北京索萊寶)，Masson三色染色試劑盒(北京Leagene)，a-SMA多克隆抗體(北京博奧森)，ck-19單克隆抗體(美國Abcam)，免疫組化檢測試劑盒PV-9002、DAB 染液(北京中杉金橋)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

周齡4～6周，體重18～23 g的健康雄性balb/c小鼠84只(購于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為7籠，每籠12只，標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度18℃至22℃/濕度50%～60%)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

三、方法

(一)動(dòng)物模型的建立

每籠balb/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(膽總管結(jié)扎組)和對照組(假手術(shù)組)，實(shí)驗(yàn)組8只，對照組4只。術(shù)前禁食8 h，手術(shù)時(shí)間定于上午9時(shí)至11時(shí)，在顯微鏡輔助下采用相對無菌操作。腹腔注射戊巴比妥鈉(3 uL/10 g)麻醉后固定小鼠，腹部備皮、消毒、鋪巾。手術(shù)切口為劍突至劍突下約1 cm腹正中線縱向切口(圖1A)，用眼科剪依次剪開皮膚、腹膜，暴露腹腔，選用彎頭止血鉗輕柔挑開肝臟，同時(shí)用生理鹽水潤濕的棉簽將腸道組織壓向小鼠尾側(cè)以充分顯露肝門，無須將腸道組織牽拉出腹腔，以免造成術(shù)后胃腸功能紊亂或腸道組織粘連，暴露過程需小心、輕柔，避免傷及肝臟組織或拉破腸系膜造成大出血。此時(shí)可見一細(xì)小、透明的膽總管位于門靜脈前方，二者之間有疏松結(jié)締組織相連。左手持眼科鑷將膽總管下段提起，右手持另一把眼科鑷，鈍性分離結(jié)蹄組織，游離膽總管(圖1B)。牽拉膽總管時(shí)輕柔，避免將其拉斷或扯破門靜脈。用6-0可吸收線于膽總管近心端結(jié)扎，不剪斷膽總管(圖1C)，隨后間斷縫合腹膜，連續(xù)縫合皮膚。消毒手術(shù)切口，小紗布包扎，避免小鼠自行抓撓傷口。對照組不結(jié)扎膽總管，其余手術(shù)步驟均相同。術(shù)后小鼠保暖，密切觀察，待完全蘇醒，能自主活動(dòng)后放回鼠籠。

圖1 balb/c小鼠膽總管結(jié)扎手術(shù)過程 A：手術(shù)切口; B：游離膽總管; C：結(jié)扎膽總管

Fig.1 Operative procedures of bile duct ligation in balb/c mice

(二)術(shù)后小鼠一般情況及肝膽大體結(jié)構(gòu)觀察

記錄術(shù)后小鼠體重變化，觀察皮毛色澤、活動(dòng)情況、尿液顏色，分別于術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死實(shí)驗(yàn)組小鼠8只，對照組4只，取材，肉眼觀察肝臟、膽囊、膽總管變化。實(shí)驗(yàn)過程中由逐漸增大的膽囊及血液檢查結(jié)果判斷，未發(fā)現(xiàn)小鼠膽總管再通情況。

(三)小鼠血清生化指標(biāo)

術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d分別取實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血液，離心機(jī)5 000 r/min，室溫離心15 min，取上層血清按全自動(dòng)生化分析儀標(biāo)準(zhǔn)程序檢測總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( aspartate aminotransferase,AST)。

(四)肝臟組織蘇木素-伊紅(HE)染色

分別取實(shí)驗(yàn)組與對照組術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d小鼠肝臟組織(約1 cm3大小)，常規(guī)脫水、包埋、切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

(五)肝臟組織masson染色

取實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠術(shù)后28 d肝臟組織切片，按masson三色染色試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟染色，觀察結(jié)果。

(六)肝臟組織免疫組織化學(xué)染色

取實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠術(shù)后28 d肝臟組織，常規(guī)石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色，檢測a-SMA(a-平滑肌肌動(dòng)蛋白)、CK-19(細(xì)胞角蛋白-19)表達(dá)情況。小鼠肝臟組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 um連續(xù)切片，60℃烤片過夜。一抗選擇1∶300兔抗小鼠a-SMA多克隆抗體、1∶600兔抗小鼠ck-19單克隆抗體，二抗為免疫組化檢測試劑盒。具體步驟：切片脫蠟、水化，微波修復(fù)15 min，3%H2O2室溫孵育20 min，PBS洗凈，山羊血清封閉45 min，孵育一抗，避光、4℃過夜，試劑1(聚合物輔助劑)室溫20 min,試劑2(PV-9001 辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物)20 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，封片，顯微鏡下觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、術(shù)后小鼠一般情況及肝膽大體結(jié)構(gòu)觀察

術(shù)后兩組小鼠活動(dòng)量均有所減少，術(shù)后第3天對照組小鼠活動(dòng)量基本恢復(fù)至術(shù)前水平，其余無明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組小鼠活動(dòng)量基本未恢復(fù)，皮毛粗糙、無光澤，耳朵、四肢、尾巴部位出現(xiàn)明顯黃疸，尿液顏色加深至深黃色。兩組小鼠體重在術(shù)后1 d均有所下降，隨后對照組小鼠體重逐漸增加，而實(shí)驗(yàn)組小鼠體重呈下降趨勢(表1)。通過取材可見，隨膽總管結(jié)扎時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)腹膜黃染，膽囊和膽總管因膽汁淤積逐漸增大，肝臟質(zhì)地變硬，表面出現(xiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)(圖2)。

表1 兩組小鼠手術(shù)后體重變化率比較(%, x±s)Table 1 Postoperative changes of body weight in mouse(%, x±s)分組術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后5 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后21 d術(shù)后28 d實(shí)驗(yàn)組(n=8)-7.343±3.501-8.854±4.573-12.750±8.009-8.366±9.042-16.350±8.752-23.285±7.010-16.529±6.938對照組(n=4)-4.073±1.113 4.908±6.612 5.110±4.655 4.385±2.289 18.605±7.119 22.148±5.239 20.300±3.387t值-1.785-4.266-4.068-2.716-6.881-11.362-9.869P值 0.105<0.001<0.001 0.001<0.001<0.001<0.001

圖2 兩組小鼠手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟組織大體結(jié)構(gòu)圖 A:術(shù)后1 d; B：術(shù)后3 d; C：術(shù)后5 d; D：術(shù)后7 d; E：術(shù)后14 d; F：術(shù)后21 d; G:術(shù)后28 d ；實(shí)驗(yàn)組(左)與對照組(右)

Fig.2 Gross structures of murine liver tissue at different postoperative timepoints

二、小鼠生化檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組小鼠隨結(jié)扎時(shí)間延長，血清TBIL、DBIL逐漸升高，術(shù)后14 d達(dá)峰值，隨后下降直至總體趨于平穩(wěn)；ALT、AST于術(shù)后第1天達(dá)到高峰，隨后稍有下降，第3天至第7天再次緩慢升高，隨后逐步下降并趨于平穩(wěn)。而對照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TBIL、DBIL、ALT、AST值均無明顯變化(表2、圖3)。

表2 兩組小鼠手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)生化檢測結(jié)果比較(x±s)Table 2 Serum biochemical profiles of mouse at different postoperative timepoints(x±s)組別時(shí)間TBIL(umol/L)DBIL(umol/L)ALT(u/L)AST(u/L)實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后1 d 98.067±29.967 84.267±24.229 1441.983±485.0053415.383±1822.435 0.350±0.2651.200±0.23151.250±4.197 130.825±32.478 7.9878.3977.0234.414<0.001<0.001<0.001<0.001實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后3 d 145.712±73.304126.867±46.8161137.333±478.1001317.950±710.8010.275±0.2361.200±0.29445.650±10.895145.050±45.6835.6116.5755.5914.029<0.001<0.001<0.001<0.001實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后5 d 168.817±45.011138.283±32.8361270.983±404.3971754.067±370.6800.375±0.1501.225±0.15041.200±4.229159.850±13.4529.16610.2247.44810.524<0.001<0.001<0.001<0.001 實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后7 d 286.900±26.605201.017±30.6351453.967±377.5761780.500±1015.9800.367±0.1531.350±0.26546.450±4.276197.950±40.54326.38015.9649.1303.811<0.001<0.001<0.001<0.001 實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后14 d 377.260±126.88240.283±67.628633.683±133.679644.417±125.2840.400±0.1831.150±0.20852.325±8.739174.525±15.0456.6428.66110.6199.089<0.001<0.001<0.001<0.001實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后21 d 255.100±50.560223.883±39.363409.283±114.169436.850±118.6170.3250±0.12581.100±0.182647.250±4.5332171.050±19.391212.34313.8637.7565.382<0.001<0.001<0.001<0.001 實(shí)驗(yàn)組對照組t值P值術(shù)后28 d 204.100±57.9378181.217±59.8222482.333±118.4465445.017±113.64470.3250±0.09571.175±0.298649.500±8.4526173.200±16.21588.6157.3728.9175.771<0.001<0.001<0.001<0.001

圖3 兩組小鼠手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清生化檢測結(jié)果圖

Fig.3 Serum biochemical profiles of mice at different postoperative timepoints

三、 肝臟組織HE染色結(jié)果

分別取兩組小鼠術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d肝臟組織行HE染色，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后第3天標(biāo)本中可見較多炎性細(xì)胞，匯管區(qū)出現(xiàn)膽管上皮樣細(xì)胞增生、膽管擴(kuò)張以及膽管周圍纖維組織增生。術(shù)后28 d，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織可見少量壞死肝細(xì)胞，大量增生的膽管上皮樣細(xì)胞，增生膽小管周圍大量膠原纖維，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，島嶼狀假小葉結(jié)構(gòu)形成。對照組小鼠肝臟組織未見炎癥和壞死細(xì)胞，肝板排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常完整(圖4)。

四、肝臟組織 Masson染色結(jié)果

選取兩組小鼠手術(shù)后28 d肝臟組織行Masson染色，可見實(shí)驗(yàn)組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維增生(病理切片圖中藍(lán)色部分)；對照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，無膠原纖維形成(圖5)。

圖4 兩組小鼠手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟組織形態(tài)圖(HE染色，×100)

圖5 兩組小鼠手術(shù)后28 d肝臟纖維組織形成情況(Masson染色，×100)

Fig.5 The formation of collagen fiber in liver at 28d post-operation(Masson stain,×100)

(六)肝臟組織免疫組織化學(xué)染色

選取兩組小鼠術(shù)后28 d肝臟組織行免疫組織化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)組可見a-SMA大量表達(dá)，提示肌成纖維細(xì)胞大量增生，而對照組無表達(dá)；CK-19為膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞(病理切片圖中標(biāo)棕色部分)數(shù)量明顯增高，呈花環(huán)狀排列(t=6.150，P<0.001)，見圖6。

圖6 兩組小鼠手術(shù)后28 d肝臟組織a-SMA，CK-19表達(dá)情況(×200) A：免疫組織化學(xué)結(jié)果; B：CK-19陽性細(xì)胞面積百分比半定量分析結(jié)果

Fig.6 The expression patterns of a-SMA and CK-19 in liver at 28d post-operation(×200)

討 論

由于膽汁淤積及膽汁酸的毒性作用，肝細(xì)胞可出現(xiàn)進(jìn)行性損傷，最終可發(fā)展為肝硬化甚至肝衰竭。因而，膽汁淤積性損傷是肝纖維化、肝硬化的重要危險(xiǎn)因素[5,6]。

膽總管手術(shù)動(dòng)物模型自1872年首次應(yīng)用以來，一直被推舉為研究進(jìn)行性肝損傷的經(jīng)典模型。憑借簡單、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于進(jìn)行性肝病的多方面研究：如動(dòng)態(tài)評估肝硬化形態(tài)學(xué)與生化指標(biāo)，探索促纖維化信號通路，剖析不同細(xì)胞亞群、基因在肝纖維化進(jìn)程中的作用，測試抗纖維化相關(guān)藥物[7,8]。近年來，國內(nèi)外在構(gòu)建該動(dòng)物模型時(shí)多采用膽總管雙重結(jié)扎以避免其發(fā)生再通；如需研究較少纖維化形成和進(jìn)行性肝細(xì)胞增殖的關(guān)系時(shí)，可選擇結(jié)扎部分膽總管，或部分膽總管結(jié)扎聯(lián)合膽囊切除術(shù)，以此來預(yù)防膽汁淤積引起的急性膽囊炎[9]；更有學(xué)者熟練掌握了建立膽道吻合動(dòng)物模型的先進(jìn)顯微技術(shù)[10]。

本研究團(tuán)隊(duì)通過前期不斷總結(jié)，選擇balb/c小鼠行經(jīng)腹中線小切口膽總管結(jié)扎術(shù)，致肝外膽管阻塞，成功構(gòu)建了膽汁淤積性肝硬化動(dòng)物模型。當(dāng)然，也有部分研究者選擇膽總管較粗的大鼠作為動(dòng)物模型，便于尋找及結(jié)扎膽總管；同時(shí)大鼠術(shù)后耐受能力較好，存活率高。但大鼠無膽囊結(jié)構(gòu)，可能干擾到肝硬化形成時(shí)間與動(dòng)態(tài)改變。肖顏玉、羅丹[11,12]的研究中早期將小鼠膽總管結(jié)扎至術(shù)后14 d，有文獻(xiàn)指出，小鼠膽總管結(jié)扎術(shù)后14 d處于早期纖維化水平，28 d達(dá)中晚期肝硬化水平[13]。因此，本研究將造模最長時(shí)間定為術(shù)后4周，以便研究小鼠中晚期膽汁淤積性肝硬化的病理改變，其中小鼠術(shù)后21 d平均存活率91.67%，術(shù)后28 d平均存活率為75%。小鼠膽總管位于腹中線稍右方，由左右肝管匯合而成，采用腹中線豎切口，可減少損傷腹壁血管引起的出血，也便于找尋膽總管[14]。長度1 cm的小切口可充分減輕手術(shù)損傷，同時(shí)暴露膽總管時(shí)無需翻動(dòng)胃腸道，減少了腸系膜血管破裂、出血的風(fēng)險(xiǎn)，也降低術(shù)后發(fā)生腹腔粘連的可能性；顯微鏡的使用可進(jìn)一步減輕門靜脈損傷。為保證模型的重現(xiàn)性，所有小鼠結(jié)扎點(diǎn)均選在左右肝管匯合處稍下方。

膽總管結(jié)扎術(shù)后，隨時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組小鼠逐漸出現(xiàn)一系列與膽汁淤積性肝硬化患者相似的癥狀、體征。取材可見小鼠腹膜呈黃色，膽汁淤積至膽囊腫大、膽總管擴(kuò)張，肝臟質(zhì)地變硬；術(shù)后21 d肝臟表面可見顆粒狀結(jié)節(jié)，以上為膽總管結(jié)扎手術(shù)成功的直接證據(jù)。TBIL、DBIL為膽汁淤積的血清生化指標(biāo)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠TBIL、DBIL在術(shù)后14 d達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，直至28 d總體趨于平穩(wěn)，證實(shí)膽總管結(jié)扎引起了進(jìn)行性的肝臟損害[7,15]。ALT、AST是評估肝臟損傷的常用臨床指標(biāo)，術(shù)后1 d，二者在實(shí)驗(yàn)組小鼠中均達(dá)高峰，分析原因可能是手術(shù)的急性損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞應(yīng)激；隨后稍有下降，術(shù)后7 d再次升高，14 d至28 d逐漸下降進(jìn)入相對平穩(wěn)狀態(tài)，其原因可能是肝細(xì)胞經(jīng)過自我調(diào)節(jié)和修復(fù)后仍不能代償至正常水平。有學(xué)者對SD大鼠行膽總管結(jié)扎術(shù)，發(fā)現(xiàn)ALT、AST水平在術(shù)后第3天達(dá)高峰，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)稍有差別，可能上述指標(biāo)的定量結(jié)果受不同膽總管結(jié)扎部位影響，或大小鼠對手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)和耐受程度不同。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)HE染色結(jié)果直接顯示了小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)改變[6]，實(shí)驗(yàn)組小鼠可見肝細(xì)胞壞死、膽管樣結(jié)構(gòu)增生、假小葉形成，符合膽汁淤積性肝硬化患者肝臟組織HE染色結(jié)果；而對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞由中央靜脈向外周呈輻射狀排列，由此也為該動(dòng)物模型的成功構(gòu)建提供了有力證據(jù)。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將患有膽汁淤積性肝硬化的患者肝臟組織切片進(jìn)行HE染色，膽小管結(jié)構(gòu)內(nèi)可見黃棕色膽汁，而小鼠結(jié)扎膽總管模型中，術(shù)后28 d小鼠肝臟組織仍沒有在增生的膽總管中發(fā)現(xiàn)膽汁，其原因可能是人和小鼠存在物種差異，或構(gòu)建模型時(shí)間尚未達(dá)到形成膽汁所需的時(shí)間，具體原因有待進(jìn)一步探索。Masson染色中，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后28 d肝臟組織可見正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，膠原纖維增生明顯，纖維化逐步形成。同時(shí)通過免疫組織化學(xué)染色檢測了術(shù)后28 d 兩組小鼠肝臟組織中a-SMA和CK-19的表達(dá)情況，a-SMA為肌成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物，其在肝臟組織中表達(dá)量增加提示存在肝星狀細(xì)胞活化[6,7,16-18]?；罨母涡菭罴?xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞因子增多，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，逐漸發(fā)展為肝硬化。本研究實(shí)驗(yàn)組可見a-SMA表達(dá)量明顯增加，且主要集中于匯管區(qū)，說明匯管區(qū)可能是肝硬化形成的起始部位。CK-19為膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物[7,19]，可形成膽管結(jié)構(gòu)，選用表皮生成素可選擇性誘導(dǎo)CK-19表達(dá)上調(diào)[20]。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組匯管區(qū)CK-19表達(dá)量明顯增多且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明經(jīng)膽總管結(jié)扎術(shù)的小鼠肝臟組織有明顯的膽管上皮細(xì)胞增生，膽小管形成，符合膽汁淤積性肝硬化患者肝臟組織結(jié)構(gòu)。通過對比實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的一般情況、血清學(xué)變化、組織學(xué)改變，證實(shí)了腹中線小切口膽總管結(jié)扎術(shù)是一種簡單、重復(fù)性強(qiáng)的膽汁淤積性肝硬化動(dòng)物模型。

雖然本研究基本達(dá)到了預(yù)期的研究目的，但我們的實(shí)驗(yàn)仍存在一些不足，如暫未檢測到術(shù)后小鼠血清GGT的改變；小鼠膽總管結(jié)扎后更長時(shí)間引起的肝臟病理改變也有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)然，在所有肝病研究中，采用膽總管結(jié)扎的方式進(jìn)行建模仍然存在一定局限性，雖然其可模擬肝外膽道梗阻引起的膽汁淤積性肝硬化，但不能模擬膽道感染或自身免疫性肝炎等導(dǎo)致的肝內(nèi)外膽道病變。