徐仁慶，李建飛，陸松花，郁 霖

(1.蘇州技師學(xué)院，江蘇 蘇州 215000； 2.佐竹機(jī)械(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215000)

谷物作為人類(lèi)食物與魚(yú)禽畜飼料的重要來(lái)源，從種植管理到儲(chǔ)藏及加工的各個(gè)環(huán)節(jié)，其安全品質(zhì)不可避免的會(huì)受到各種不利因素的影響，如環(huán)境污染因素、農(nóng)藥與化肥濫施因素、糧食的儲(chǔ)存不當(dāng)因素等。如今，谷物的品質(zhì)安全早已成為全人類(lèi)所面臨的共同問(wèn)題。我國(guó)作為產(chǎn)糧大國(guó)，谷物的品質(zhì)安全問(wèn)題更是不容忽視。相關(guān)報(bào)道指出，當(dāng)前我國(guó)谷物的品質(zhì)安全隱患重點(diǎn)存在于以下3個(gè)方面：一是真菌污染率高且污染情況復(fù)雜；二是一些污灌區(qū)或礦區(qū)較為突出的重金屬超標(biāo)問(wèn)題；三是種植與管理過(guò)程中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題[1]。近些年來(lái)的谷物安全相關(guān)調(diào)查結(jié)果也反映出，國(guó)內(nèi)谷物及其制品的安全問(wèn)題不容樂(lè)觀。如宮春波等在2014-2017年間對(duì)煙臺(tái)市市售4類(lèi)225種谷物及其制品進(jìn)行隨機(jī)抽樣，檢測(cè)得出玉米、小麥及其制品真菌毒素污染情況普遍存在，且檢出率均達(dá)到50%以上(55.2%與53.85%)[2]。許嘉等對(duì)北京市市售谷物制品進(jìn)行真菌毒素與重金屬檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大米、小麥粉、玉米、玉米面均受到不同程度的真菌毒素污染[3]；玉米面與小麥粉受到不同程度的鎘污染和鉛污染[4]。楊柳等[5]對(duì)河北省的雞類(lèi)飼料原料進(jìn)行重金屬分析，結(jié)果表明絕大部分飼料原料中鎘超標(biāo)；谷物及其多數(shù)加工制品、膨化大豆和棉籽粕中鉛超標(biāo)；小部分飼料的鎘與砷超標(biāo)。吳雨珊等[6]對(duì)國(guó)內(nèi)奶牛飼料進(jìn)行調(diào)查分析顯示，敵敵畏和氟氯氰菊酯在玉米飼料中的檢出率均達(dá)到100%，溴氰菊酯在玉米飼料和精料補(bǔ)充料中的檢出率均超過(guò)80%。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于谷物及其制品的安全品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)多采用色譜法及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等，該類(lèi)方法雖然較為權(quán)威，但由于設(shè)備價(jià)格與設(shè)備維護(hù)費(fèi)用昂貴，且對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)能力要求高，因此具有很大局限性。近些年來(lái)，為滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)于低成本與快速檢測(cè)的需求，生物傳感器作為農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)快速檢測(cè)的新型技術(shù)得到了快速發(fā)展。

1 生物傳感器概述

生物傳感器是一種結(jié)合了生物識(shí)別機(jī)制和物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的分子傳感器[7]。其工作原理是待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入分子識(shí)別元件(生物活性材料)，經(jīng)分子識(shí)別作用與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生化反應(yīng)，所產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過(guò)相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)換為可以定量處理的光信號(hào)或電信號(hào)，最后經(jīng)電子測(cè)量?jī)x的放大、處理與輸出，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)濃度進(jìn)行檢測(cè)分析的目的[8]。按照生物活性材料的種類(lèi)進(jìn)行劃分，可分為微生物型傳感器、免疫型傳感器、酶?jìng)鞲衅鳌⒓?xì)胞傳感器、組織傳感器及DNA傳感器等。按照信號(hào)轉(zhuǎn)換元件的不同進(jìn)行劃分，又可分為電化學(xué)生物傳感器、介體生物傳感器、光學(xué)型生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、量熱型生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等[9]。在農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)檢測(cè)方面，生物傳感器以其檢測(cè)速度快、靈敏度較高、特異性強(qiáng)、價(jià)格較為低廉等優(yōu)點(diǎn)一直備受研究者的關(guān)注。

2 生物傳感器在谷物安全品質(zhì)檢測(cè)上的應(yīng)用

2.1 真菌毒素

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次生代謝物，可對(duì)農(nóng)作物、食品及飼料等植物性產(chǎn)品造成廣泛污染[10]。尤其是在谷物的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏期間，不當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件可加速真菌的滋長(zhǎng)與繁殖，促使真菌毒素的不斷富集。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)對(duì)于谷物中真菌毒素的檢測(cè)項(xiàng)目主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪膚鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)，以及玉米赤霉烯酮(ZEA)四大類(lèi)。以上谷物真菌毒素的攝入可引起不同程度的急性或慢性中毒，如AFB1可引發(fā)惡性營(yíng)養(yǎng)不良、急性肝炎、肝硬化、肝癌，以及雷氏癥候群等病癥，被國(guó)際癌癥研究所認(rèn)定為最強(qiáng)基因毒性劑；DON又稱(chēng)為嘔吐毒素，可引起嘔吐、胃腸炎、免疫抑制和血液病等；OTA可對(duì)人體腎臟及免疫系統(tǒng)造成損害，并有潛在的致畸、致癌危害；ZEA則會(huì)引發(fā)雌激素綜合癥等。

目前，國(guó)內(nèi)外在谷物真菌毒素檢測(cè)用生物傳感器的研究上多集中在酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器及新型材料方面。其中在AFB1的檢測(cè)應(yīng)用上，Chrouda等[11]以AFB1對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用為基礎(chǔ)，并以海藻酸鈉生物聚合物作為固定化乙酰膽堿酯酶的新基質(zhì)制備了電化學(xué)生物傳感器；在0.1～100 ng/ml線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，檢測(cè)下限為0.1 ng/ml，低于AFB1(2 μg/L)的推薦水平，具有較高的靈敏度、良好的重復(fù)性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性；同時(shí)用添加AFB1(0.5 ng/ml)的大米樣品評(píng)價(jià)了該方法的適用性。Bhardwaj等[12]使用納米顆粒集成金芯片開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記的超敏感微流表面等離子體共振生物傳感器用于檢測(cè)AFB1，其線(xiàn)性測(cè)定范圍在1～50 nm，檢測(cè)限為0.19 nm；通過(guò)加標(biāo)的小麥樣品評(píng)估了所提出的生物傳感器的有效性，其平均回收率(93%和90.1%)是可以接受的。Díaz Nieto等[13]基于由大豆過(guò)氧化物酶和化學(xué)還原的氧化石墨烯復(fù)合物修飾的玻璃碳電極，通過(guò)基于響應(yīng)面方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了構(gòu)建生物傳感器的最佳條件，進(jìn)而開(kāi)發(fā)了第三代酶生物傳感器，對(duì)摻有曲霉素的玉米樣品進(jìn)行分析，平均回收率為96.5%?；s[14]通過(guò)引入電位分辨比率原理，配合筆記本電腦與微型電化學(xué)工作站，開(kāi)發(fā)出了可以在陽(yáng)光照射下即可工作的新型光電化學(xué)生物傳感平臺(tái)，并成功應(yīng)用于AFB1的檢測(cè)，就此消除了陽(yáng)光強(qiáng)度隨時(shí)間和氣候而變化所引起的干擾。

在DON的檢測(cè)應(yīng)用上，Schnerr等[15]基于表面等離振子共振(SPR)的間接抑制性免疫分析方法，合成DON-生物素偶聯(lián)物，并將其固定在鏈霉親和素包被的SPR傳感器表面，以測(cè)量添加到小麥樣品中的游離抗DON抗體，分析顯示，使用新型生物傳感器與氣相色譜/質(zhì)譜及高效液相色譜法測(cè)得的DON濃度之間呈線(xiàn)性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.946 4與0.906 6。Ong等[16]以鐵納米花-石墨烯-鎳(INFGN)為傳感器，特異性適體為生物識(shí)別元件，研制了一種選擇性生物傳感系統(tǒng)，其對(duì)DON的檢測(cè)限為2.11 pg/ml，且48 h后仍保持30.65%的活性，具有很高的穩(wěn)定性。Zheng等[17]基于表面活性劑輔助合成TiO2介晶的雙功能試劑調(diào)節(jié)比例電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，通過(guò)發(fā)光氨和緩沖液(4,4'-二羧酸-2,2'-聯(lián)吡啶基)的兩個(gè)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)比來(lái)檢測(cè)DON，檢測(cè)范圍為0.05～5 ng/ml，檢測(cè)限為1.67×10-2pg/ml。韓逸陶等[18]基于無(wú)模板合成鳥(niǎo)嘌呤四聚體(G-quadruplex,G4)方法，以及G4與特異性染料分子結(jié)合后的熒光增強(qiáng)效用，并利用DON與其適體DNA的高親和作用以及核酸外切酶的酶切反應(yīng)，構(gòu)建了可快速分析谷物中DON的熒光“開(kāi)啟”的生物傳感器。其在用于添加DON的小麥和玉米樣品實(shí)驗(yàn)中，回收率為94%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～4.9%。

在OTA的檢測(cè)應(yīng)用上，Rubaye等[19]首次報(bào)道了適體作為OTA的高度特異性人工分子受體與全內(nèi)反射橢圓偏振法(TIRE)的結(jié)合使用；研究結(jié)果表明，用特異適體直接檢測(cè)OTA的濃度可降至0.01 ng/ml；通過(guò)動(dòng)態(tài)TIRE光譜測(cè)量研究了適配體/OTA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，其可評(píng)估的親和力常數(shù)KD=1.8×10-8mol/L，這是高度特異性適配體/OTA結(jié)合的特征。張立轉(zhuǎn)等[20]基于聚多巴胺納米顆粒熒光猝滅效率高，以及核酸適配體特異性的識(shí)別能力特點(diǎn)，構(gòu)建了一種用于OTA定量檢測(cè)的快速、靈敏、簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的熒光生物傳感器，其檢出限為20 nmol/L。Kim等[21]基于金納米材料，并將其部分嵌入固體基質(zhì)(如聚二甲基硅氧烷)，開(kāi)發(fā)了一種固態(tài)單步適配傳感器，其線(xiàn)性范圍為0.1～1 000 ng/ml，檢測(cè)限為0.022 ng/ml(在30 min內(nèi)到達(dá)OTA)，此外通過(guò)3次循環(huán)檢測(cè)與回收的可重復(fù)使用性評(píng)估確定了其很好的可重復(fù)使用性；該項(xiàng)研究為便攜式、可重復(fù)使用的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)用生物傳感器平臺(tái)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。Hao等[22]開(kāi)發(fā)出一個(gè)便攜式太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)的可視化的電化學(xué)生物傳感器，該傳感器被制造在一個(gè)小的ITO電極上，該電極分為檢測(cè)模塊與參考模塊兩部分；每個(gè)模塊由兩個(gè)區(qū)域組成，其中三維石墨烯水凝膠納米復(fù)合材料用于構(gòu)建光電感應(yīng)區(qū)域，電致變色材料普魯士藍(lán)用于可見(jiàn)區(qū)域；通過(guò)兩個(gè)模塊上可視區(qū)域的色度比率進(jìn)行量化，獲得了良好的線(xiàn)性范圍(1～500 ng/ml)，檢出限為0.29 ng/ml。

在ZEA的檢測(cè)應(yīng)用上，Azri等[23]采用半胱胺鹽酸鹽和1,4-亞苯基二異氰酸酯鍵合，用ZEA修飾金電極，將解離常數(shù)為(13.4±2.1)nm的截短型ZEA適體應(yīng)用于適配傳感器。該傳感器與其他ZEA類(lèi)似物有高度的交叉反應(yīng)，而對(duì)其他真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)；其檢測(cè)范圍在0.01～1 000 ng/ml，檢測(cè)限為0.017 ng/ml；用于玉米籽粒提取物中玉米醇溶蛋白的ZEA測(cè)定，回收率為87%～110%。Moradi等[24]使用電紡絲技術(shù)制造了一種摻入聚丙烯腈/納米纖維改性的筆形石墨電極，以應(yīng)用于食品模擬物中，尤其是液態(tài)食品，用以檢測(cè)ZEA。該傳感器是在室溫下使用pH6的Britton-Robinson緩沖液制成，對(duì)ZEA在5～30和60～100 nmol/L的濃度范圍內(nèi)具有線(xiàn)性行為和良好特性。Wu等[25]將合成的高熒光上轉(zhuǎn)換納米粒子與ZEA適體互補(bǔ)寡核苷酸偶聯(lián)作為信號(hào)探針，并將ZEA適體固定化的磁性納米粒子作為捕獲探針，結(jié)果表明，在0.05～100 μg/L范圍內(nèi)，其檢測(cè)限(玉米0.126 μg/kg，啤酒0.007 μg/L)明顯低于現(xiàn)有方法；通過(guò)將實(shí)際食品樣品中的測(cè)定結(jié)果與商業(yè)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證了競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法的可靠性。Sadrabadi等[26]研究表明使用雙鏈DNA/多壁碳納米管-聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的筆形石墨電極，可通過(guò)檢測(cè)ZEA與雙鏈DNA的相互作用測(cè)定低至0.005 ng/ml的痕量ZEA。

2.2 農(nóng)藥殘留

為防治病、蟲(chóng)、草害，保障谷物長(zhǎng)勢(shì)與產(chǎn)量，各類(lèi)殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑、激素類(lèi)藥劑等的施用已貫穿于谷物萌芽到植株生長(zhǎng)的整個(gè)生命周期中，且以殺蟲(chóng)劑的使用最為頻繁。其中有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑以其廣譜、高效、價(jià)格較低的特點(diǎn)被廣泛使用于植保管理中，但是其高毒性與高殘留的特點(diǎn)也給谷物及其制品的安全問(wèn)題帶來(lái)巨大隱患。目前，在有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)上，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)對(duì)植物源性食品中90種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定作出了具體說(shuō)明，測(cè)定方法為氣相色譜法。在生物傳感器研究應(yīng)用上，基于有機(jī)磷對(duì)乙酰膽堿酶活性的抑制作用，以及乙酰膽堿酯酶酶抑制生物傳感器可避開(kāi)大量的預(yù)處理的特點(diǎn)，使之為樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥痕量殘留的快速檢測(cè)提供了可能性[27]。如高慧麗等[28]所制備的乙酰膽堿酯酶生物傳感器，采用溶膠-凝膠法在醋酸纖維膜上將酶固定，然后將該酶膜在聚四氨基鈷酞菁修飾的玻碳電極上進(jìn)行固定，再采用計(jì)時(shí)安培法對(duì)對(duì)硫磷、辛硫磷與氧化樂(lè)果進(jìn)行測(cè)定，其檢測(cè)限依次為2.0×10-9mol/L、1.4×10-9mol/L和1.1×10-8mol/L。薛瑞等[29]采用層層自組裝技術(shù)并通過(guò)靜電引力把乙酰膽堿酶與金納米粒子固定到玻碳電極表面，所制備的酶?jìng)鞲衅鲗?duì)不同濃度甲基對(duì)硫磷進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為7.6×10-6mol/L。Zhang等[30]通過(guò)聚合4,7-二(呋喃-2-基)苯并噻二唑與Ag-rGO-NH2的協(xié)同作用，開(kāi)發(fā)了基于共軛聚合物和Ag-rGO-NH2納米復(fù)合材料的高靈敏度安培乙酰膽堿酯酶生物傳感器。在優(yōu)化后的傳導(dǎo)條件下，馬拉硫磷的檢出限約為0.032 μg/L，敵百蟲(chóng)的檢出限約為0.001 μg/L。關(guān)樺楠等[31]以多層納米酶膜修飾電極為核心，采用脂質(zhì)體技術(shù)制備乙酰膽堿酯酶的微反應(yīng)器，并以微反應(yīng)器、殼聚糖及二氧化硅為基質(zhì)，構(gòu)建了有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)酶電化學(xué)生物傳感器，其對(duì)敵敵畏的最低檢出限為(0.72±0.065)μg/L，且靈敏度高、重復(fù)性與選擇性好。衛(wèi)銀銀等[32]研究報(bào)道了二氧化鉛或二氧化鈦修飾的乙酰膽堿酶生物傳感器具有光電協(xié)同催化功能；且乙酰膽堿酶表現(xiàn)出良好的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，其對(duì)敵百蟲(chóng)的最低檢出限達(dá)到1.0 nmol/L。Nagabooshanam等[33]在10～120 ng/L的濃度范圍內(nèi)，研究了基于聚苯胺和羧基官能化的多壁碳納米管的超靈敏電化學(xué)傳感器在檢測(cè)實(shí)際樣品中有機(jī)磷酸鹽的效果，結(jié)果表明毒死蜱的靈敏度為0.41 mA·(ng/L)-1·cm-2，檢出限為8.8 ng/L；對(duì)甲基對(duì)硫磷的靈敏度為0.58 mA·(ng/L)-1·cm-2，檢出限為10.2 ng/L。

2.3 重金屬

谷物在種植管理過(guò)程中，重金屬離子可通過(guò)水、藥、肥等多種途徑被谷物植株吸收。雖然最終到達(dá)并存在于谷物籽粒中的重金屬含量極小，但這些痕量重金屬可通過(guò)食物鏈直接或間接的在人體內(nèi)不斷富集；一旦超過(guò)人體耐受限度，將會(huì)引起急性、亞急性或慢性中毒，危害人體健康。因而重金屬檢測(cè)對(duì)于保障谷物及其制品的安全品質(zhì)必不可少。我國(guó)最新標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)對(duì)于谷物中重金屬的檢測(cè)項(xiàng)目主要包括鉛、鎘、汞、砷、鉻5種。在檢測(cè)方法上，常規(guī)方法測(cè)定步驟主要包括樣品的消解處理(如壓力罐消解、回流消解、微波消解、濕式消解、干式灰化等)與質(zhì)譜或光譜分析(包括冷原子吸收光譜法、原子吸收光譜法、原子熒光光譜法，以及電感耦合等離子質(zhì)譜法等)[34]。在快速檢測(cè)技術(shù)的研究與應(yīng)用上，基于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的試劑條與試劑盒產(chǎn)品，因其成本較低、特異性強(qiáng)、可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、且對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)要求不高等優(yōu)點(diǎn)，在谷物等農(nóng)產(chǎn)品的重金屬檢測(cè)上得到較高推廣。其次，X射線(xiàn)熒光類(lèi)設(shè)備因其無(wú)需消解、無(wú)需試劑耗材、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣、靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)也備受關(guān)注；但由于該類(lèi)型設(shè)備開(kāi)發(fā)技術(shù)難度高，致使國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上可見(jiàn)到的X射線(xiàn)熒光類(lèi)谷物重金屬檢測(cè)儀廠商也只有寥寥幾家，如江蘇天瑞、鋼研納克，以及美國(guó)三值，且市場(chǎng)價(jià)格也十分高昂，在推廣使用上具有很大局限性。而有關(guān)生物傳感器在食品重金屬檢測(cè)方面的研究?jī)H有少量報(bào)道，如楊文平等以磁性Fe3O4納米粒子的過(guò)氧化物酶活性作為傳感信號(hào)輸出工具，并以核酸適配體的特異性識(shí)別功能作為靶標(biāo)識(shí)別元件，開(kāi)發(fā)了一種可簡(jiǎn)單快速檢測(cè)Cd離子與Pb離子的比色傳感器[35]。

3 小結(jié)與展望

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于生物傳感器在谷物安全品質(zhì)的快速檢測(cè)應(yīng)用上，多集中在真菌毒素與農(nóng)藥殘留方面，而在重金屬檢測(cè)方面的研究較少，且相應(yīng)檢測(cè)設(shè)備在實(shí)際應(yīng)用中也均存在著諸多方面的局限性，如檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)穩(wěn)定性、檢測(cè)便利性等。但生物傳感器技術(shù)作為一種涵蓋生物化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及材料學(xué)等多學(xué)科融合技術(shù)，隨著各學(xué)科技術(shù)與多學(xué)科融合技術(shù)研究的不斷發(fā)展，其在谷物安全品質(zhì)快速檢測(cè)應(yīng)用方面的諸多局限性也必將一一打破。此外，為滿(mǎn)足不同谷物流通過(guò)程中不同環(huán)節(jié)的檢測(cè)要求，谷物用生物傳感器設(shè)備也必將從單一化到多樣化，從普適性到針對(duì)性方向發(fā)展。