馬 婷，夏光華，李 川，申鉉日*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

骨組織平衡由成骨細(xì)胞調(diào)控的骨形成和破骨細(xì)胞調(diào)控的骨吸收共同維持[1]。破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一負(fù)責(zé)骨吸收的細(xì)胞，遷移到骨吸收的位置，黏附到鈣組織上，形成褶皺區(qū)和空泡區(qū)，同時(shí)分泌質(zhì)子和溶菌酶到褶皺區(qū)下方降解骨基質(zhì)和膠原蛋白基質(zhì)，形成骨吸收陷窩[2]。破骨細(xì)胞活性不斷增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致骨重建失衡，進(jìn)而引發(fā)多種骨疾病，例如骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和畸形性骨炎[3]。抑制破骨細(xì)胞及破骨前體細(xì)胞分化是維持骨吸收和骨形成動(dòng)態(tài)平衡的基本方式[4]。目前，許多雙膦酸鹽藥物以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡作為主要的抗再吸收治療靶點(diǎn)。然而，它們具有一定的副作用，例如頜骨壞死和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。因此，人們迫切希望尋找和開發(fā)治療骨基質(zhì)代謝疾病的新型天然物質(zhì)。

羅非魚是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)養(yǎng)殖的淡水魚類，其加工產(chǎn)品以凍羅非魚片為主，在加工過(guò)程中產(chǎn)生大量魚頭、魚皮和魚骨等下腳料，而羅非魚頭中含有豐富的磷脂成分，可作為水產(chǎn)保健食品的原料進(jìn)行開發(fā)利用[6]。磷脂是細(xì)胞膜的基本組成成分，具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)血脂、改善記憶、延緩衰老等多種重要生理功能，這些生理活性與其脂肪酸組成和由磷酸相連的取代基團(tuán)（含氨堿或醇類）的組成密切相關(guān)[7]。與陸生生物磷脂相比，水產(chǎn)生物體內(nèi)的磷脂富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)磷脂具有治療骨疾病的生物學(xué)作用：Wu Zhou等[9]在小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體能夠抑制破骨細(xì)胞的形成；Hartmann等[10]發(fā)現(xiàn)在外源性的補(bǔ)充卵磷脂后，大鼠對(duì)角叉菜膠性關(guān)節(jié)炎得到明顯的緩解。然而，鮮見關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物磷脂對(duì)破骨細(xì)胞的分化與凋亡影響的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用羅非魚頭磷脂（tilapia head phospholipid，TH-PL），探討其對(duì)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7分化成破骨細(xì)胞的影響，為TH-PL作為一種治療骨基質(zhì)代謝疾病的新型功能性食品的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為提高羅非魚的附加值并緩解環(huán)境污染問題提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚由海南翔泰漁業(yè)股份有限公司提供；RAW264.7細(xì)胞 北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、25%胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；核因子κB受體活化因子受體的配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL） 美國(guó)Peprotech公司；DHA、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒、羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123） 美國(guó)Sigma公司；Muse? Annexin V & Dead Cell試劑盒 德國(guó)Merck Millipore公司；Caspase-3抗體 美國(guó)Cell Signaling公司；GAPDH抗體 杭州賢至科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR） 德國(guó)Bruker公司；SMP7多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；Z326K低溫離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；MCO-175二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；CKX 41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司；6890N氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 TH-PL的制備

按照Chen Liping等[11]描述的方法提取羅非魚頭脂質(zhì)并稍作修改。用自來(lái)水清洗羅非魚頭以去除魚鰓等雜質(zhì)，組織粉碎機(jī)粉碎，真空冷凍干燥后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（料液比1∶10，m/V）在25 ℃下超聲提取1.5 h，重復(fù)萃取3 次。抽濾后，將濾液真空蒸發(fā)并濃縮至浸膏狀。通過(guò)氯仿-甲醇-水（8∶4∶3，V/V）溶液混懸上述脂質(zhì)5 min以除去色素等雜質(zhì)，然后在25 ℃、4 000 r/min離心10 min。收集氯仿層并加入0.2 倍體積的0.9 g/100 mL NaCl溶液，漩渦1 min以除去蛋白質(zhì)。25 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集下層有機(jī)相并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，即為羅非魚頭的總脂質(zhì)。將脂質(zhì)溶于氯仿中，采用硅膠柱層析進(jìn)行分離，用氯仿、丙酮和甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫劑與洗脫時(shí)間分別為：氯仿（0～15 min）、丙酮（15～30 min）、甲醇（30～40 min）；洗脫條件：進(jìn)樣量2 mL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，流速10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)210 nm。最終得到組分I（fraction I，F(xiàn)r I）、II（fraction II，F(xiàn)r II）、III（fraction III，F(xiàn)r III）。

1.3.2 薄層色譜檢識(shí)

Fr III點(diǎn)樣于被酸處理的MF-254硅膠板上（pH 5），分別以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）溶液和Dittmer-Lester試劑為展開劑和顯色劑進(jìn)行磷脂的薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢識(shí)[12]。

1.3.3 FTIR分析

將TH-PL涂抹于KBr薄片上。使用紅外光譜儀在4 000～500 cm-1進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)吸收峰的位置判斷磷脂的特征官能團(tuán)。

1.3.4 脂肪酸分析

根據(jù)Cruz-Hernandez[13]和Lei Lin[14]等的方法，進(jìn)行TH-PL的脂肪酸分析。將TH-PL甲基化，用正己烷溶解于進(jìn)樣瓶，使用熔融CP-Sil 88石英毛細(xì)管柱（100 mh0.25 mm，0.2 μm）進(jìn)行脂肪酸甲酯鑒定。氫氣作為載氣，流速為30 mL/min。程序性升溫總共持續(xù)86 min：起始溫度45 ℃，持續(xù)4 min；以13 ℃/min的速率升溫至175 ℃，持續(xù)27 min；然后升至215 ℃，速率為4 ℃/min，最后在215 ℃保持35 min。對(duì)比脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰保留時(shí)間，分析TH-PL中脂肪酸的成分，并采用面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基（含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素），培養(yǎng)于T25瓶中，每天按照休積比1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.6 TH-PL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

細(xì)胞活性采用MTT法測(cè)定。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度為2h104個(gè)/mL的RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔板，培養(yǎng)16 h。用含有TH-PL（0、12.5、25、50、100 μg/mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。隨后每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）孵育4 h。小心吸去全部的液體，之后加入150 μL的DMSO室溫下振蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.7 TH-PL對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響

RAW264.7細(xì)胞以2h104個(gè)/mL的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)基隨后分別替換為正常組培養(yǎng)基、破骨細(xì)胞模型組培養(yǎng)基（含50 ng/mL RANKL）、陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基（含50 ng/mL RANKL和12.5 μg/mL的DHA）和TH-PL處理組培養(yǎng)基（含50 ng/mL RANKL和25、50、100 μg/mL的TH-PL，分別為TH-PL低、中、高劑量組），隔天換液。培養(yǎng)5 d后，參照TRAP試劑盒方法進(jìn)行染色。將TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目大于3的細(xì)胞記為破骨細(xì)胞，并在100 倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

1.3.8 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響

RAW264.7細(xì)胞以2h104個(gè)/mL的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)16 h后替換為破骨細(xì)胞模型組培養(yǎng)基，3 d后更換為陽(yáng)性對(duì)照組和TH-PL處理組培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。隨后用胰蛋白酶消化并收集各組細(xì)胞，PBS清洗，4 ℃，1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基制成5h105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并按照Muse? Annexin V & Dead Cell試劑盒的方法染色。

1.3.9 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞線粒體膜電位的影響

收集各組細(xì)胞并向中加入1 mL熒光染料Rh123溶液（5 μg/mL），37 ℃避光孵育30 min。新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加于酶標(biāo)板，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm。

1.3.10 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

各培養(yǎng)組細(xì)胞在4 ℃裂解30 min，提取細(xì)胞中的總蛋白，隨后采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒統(tǒng)一各組的總蛋白濃度；調(diào)整后的蛋白樣品加入上樣緩沖液并混勻，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色等步驟后，最后以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算caspase-3蛋白的表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為至少3 次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。在SPSS 17.0軟件中通過(guò)單因素方差分析不同組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TH-PL的硅膠柱層析分離和薄層色譜檢識(shí)

圖 1 TH-PL的硅膠柱層析圖譜（a）和Fr III的薄層色譜圖（b）Fig. 1 Silica gel column chromatography of TH-PL (a) and TLC of Fr III (b)

表 1 羅非魚頭總脂及分離組分的得率Table 1 Yield of total lipids and lipid components from tilapia heads

采用硅膠柱層析對(duì)羅非魚頭總脂進(jìn)行分離，分別用氯仿、丙酮和甲醇洗脫，可獲得Fr I、Fr III和Fr III（圖1a），3 種組分得率分別為12.21%、0.75%和1.52%（表1）。Dittmer-Lester顯色劑專一地對(duì)全部磷脂顯色，顏色為藍(lán)色，而對(duì)中性脂、糖脂等化合物不顯色，如圖1b所示，F(xiàn)r III在Dittmer-Lester試劑顯色下呈藍(lán)色斑點(diǎn)（Rf＝0.84），而Fr I和Fr II沒有呈色反應(yīng)。因此，F(xiàn)r III可初步鑒定為TH-PL。鄒舟等[15]分析了鰱魚頭磷脂含量為0.98%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。綜上所述，TH-PL含量相對(duì)較高，這也為進(jìn)一步探討TH-PL的生理活性提供了可靠的理論支持。

2.2 FTIR分析結(jié)果

圖 2 TH-PL的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FTIR spectrum of TH-PL

TH-PL的紅外光譜如圖2所示，波數(shù)3 424.91 cm-1的強(qiáng)吸收為üOH的伸縮振動(dòng)；波數(shù)3 010.54 cm-1與2 853.17 cm-1的吸收峰同時(shí)出現(xiàn)，表明TH-PL中既含有飽和CH，又含有不飽和的CH；波數(shù)2 922.90 cm-1和1 463.73 cm-1分別為üCH2ü和üCH3的特征吸收峰；波數(shù)1 739.20 cm-1為飽和脂肪酸中C＝O的伸縮振動(dòng)特征吸收峰；波數(shù)1 648 cm-1為苯環(huán)的特征吸收峰；波數(shù)1 169.04 cm-1為üC＝OüOü的特征吸收峰（sn-1）；波數(shù)1 238.85 cm-1的強(qiáng)吸收峰為PO2ü的伸縮振動(dòng)；波數(shù)1 061.70 cm-1為CüOüPO2ü的伸縮振動(dòng)；波數(shù)969.53 cm-1為CüCüN+的特征吸收峰；波數(shù)720.59 cm-1為4 個(gè)üCH2ü所組成的長(zhǎng)鏈的吸收峰。本實(shí)驗(yàn)所得的TH-PL與文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂的紅外光譜結(jié)果基本一致[16-17]，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步定性所得樣品為磷脂。

2.3 脂肪酸分析結(jié)果

表 2 TH-PL的脂肪酸組成及相對(duì)含量Table 2 Fatty acid composition and distribution of TH-PL

TH-PL的脂肪酸組成如表2所示，TH-PL中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）約占總脂肪酸含量的34.84%，其中以C16:0（棕櫚酸）為主，其次為C18:0（硬脂酸）和C14:0（豆蔻酸），與文獻(xiàn)報(bào)道的在一些淡水魚和海洋生物的磷脂中存在大量的棕櫚酸相符[18-19]。單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）約占22.05%，其中以C18:1（油酸）為主，此外還含有一定量的C16:1（棕櫚油酸）。TH-PL中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）約占總脂肪酸的38%，其中C18:2n-6（亞油酸）含量最高，其次為C22:6n-3（DHA）和C18:3n-3（亞麻酸）等。ω-3 PUFA的含量為14.15%，其中EPA較少，而DHA含量相對(duì)較多，約占總脂肪酸的7.98%。通過(guò)上述分析得知，TH-PL中PUFA的種類豐富且含量較多，有望成為良好的功能性食品原料。

2.4 TH-PL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

為了檢測(cè)不同質(zhì)量濃度TH-PL對(duì)正常小鼠巨噬RAW264.7細(xì)胞是否具有毒性，本研究采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞中的活細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，TH-PL作用RAW264.7細(xì)胞2 d時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞幾乎無(wú)毒副作用，反而在高質(zhì)量濃度下具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。因此，可以排除TH-PL自身毒性對(duì)抑制破骨細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的假陽(yáng)性作用，表明0～100 μg/mL范圍內(nèi)的TH-PL可用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中。

圖 3 TH-PL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響Fig. 3 Effect of TH-PL on the viability of RAW264.7 cells

2.5 TH-PL對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響

采用RANKL誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7分化為多核破骨細(xì)胞，結(jié)果如圖4a所示，正常組RAW 264.7培養(yǎng)5 d后進(jìn)行TRAP染色，可見大小相對(duì)均一的單核巨噬細(xì)胞，而經(jīng)50 ng/mL的RANKL誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞5 d后可見大量TRAP陽(yáng)性的多核細(xì)胞（核不少于3 個(gè)），細(xì)胞體積明顯增大，表示在此條件下破骨細(xì)胞模型建立成功。圖4b為TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，與模型組相比，隨著TH-PL質(zhì)量濃度的升高，破骨細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少，細(xì)胞核的數(shù)量和細(xì)胞的平均直徑也明顯降低，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。其中，100 μg/mL TH-PL具有顯著抑制RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用，達(dá)到了與DHA陽(yáng)性對(duì)照組相似的效果。Wu Zhou[9]和Ma Hongmei[20]等研究表明，在小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中破骨前體細(xì)胞吞噬磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體后被抑制分化為破骨細(xì)胞；Er?s等[21]通過(guò)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵磷脂對(duì)慢性關(guān)節(jié)炎的形態(tài)功能和微循環(huán)特征產(chǎn)生積極作用。上述研究表明了，磷脂類物質(zhì)具有抑制骨質(zhì)疏松的效果，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但TH-PL的組成較為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步對(duì)其骨質(zhì)疏松構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究。

圖 4 TH-PL對(duì)RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響Fig. 4 Effect of TH-PL on RANKL-induced differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts

2.6 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，由細(xì)胞主動(dòng)有序高度調(diào)控，是生物體內(nèi)衰老細(xì)胞和損傷細(xì)胞死亡的重要方式[22]。經(jīng)研究表明，破骨細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵性因素[23-24]。為了明確TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的作用效果，本研究以DHA為陽(yáng)性對(duì)照，采用不同質(zhì)量濃度的TH-PL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞2 d，然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)破骨細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5所示，質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL的TH-PL和DHA均可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡，總凋亡率分別為12.07%、24.17%、22.07%，且主要為早期凋亡（Q1）。Sakakima等[25]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰膽堿通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Hep-G2的凋亡（凋亡率為3.11%），進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。王亮等[26]也報(bào)道了肝源性磷脂酰乙醇胺能夠激活SMMC-7721細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵性調(diào)節(jié)基因bcl-2和caspase-3的表達(dá)，從而誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡。上述研究表明，磷脂類物質(zhì)具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的效果，本研究發(fā)現(xiàn)TH-PL能有效促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步揭示了脂類物質(zhì)抗骨質(zhì)疏松作用的分子機(jī)理，為磷脂類物質(zhì)抗骨質(zhì)疏松作用的深入研究提供了參考。

圖 5 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響Fig. 5 Effect of TH-PL on osteoclast apoptosis

2.7 TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞線粒體膜電位及caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

圖 6 TH-PL對(duì)線粒體膜電位（a）及細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)量（b）的影響Fig. 6 Effect of TH-PL on mitochondrial membrane potential (a) and expression of caspase-3 in osteoclasts (b)

當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡信號(hào)的刺激后，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位降低，呼吸鏈斷裂，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。研究證明，線粒體膜電位與破骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[28-29]。為了明確TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞線粒體膜電位的作用效果，本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Rh123染色，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，以反映細(xì)胞線粒體膜電位高低。結(jié)果如圖6a所示，不同質(zhì)量濃度（25、50、100 μg/mL）TH-PL干預(yù)破骨細(xì)胞后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸下降，且呈劑量依賴性。當(dāng)TH-PL的質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)細(xì)胞線粒體膜電位下降到76.10%（與模型組相比）。為進(jìn)一步探討TH-PL對(duì)破骨細(xì)胞線粒體凋亡傳導(dǎo)通路的影響，實(shí)驗(yàn)采用Western blotting方法檢測(cè)TH-PL處理后破骨細(xì)胞中caspase-3表達(dá)量的變化情況。結(jié)果如圖6b顯示，與模型組相比，用50、100 μg/mL TH-PL干預(yù)細(xì)胞后，顯著地提高了caspase-3的表達(dá)量。Kim等[30]研究表明DHA可通過(guò)增加Bcl-2家族蛋白Bim的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞凋亡。在外界刺激作用下，Bim表達(dá)增高或活性增強(qiáng)后激活Bak/Bax，活化的Bak/Bax形成六聚體聚集在線粒體外膜形成孔道，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，釋放細(xì)胞色素c，與凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP結(jié)合形成的多聚體募集并活化胱天蛋白酶caspase-9，最終激活下游執(zhí)行者caspase-3、caspase-7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31-32]。在本研究中觀察到TH-PL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)線粒體膜電位的降低，caspase-3的激活來(lái)介導(dǎo)該作用，因此推測(cè)，TH-PL可能是通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的活性。

3 結(jié) 論

本研究采用溶劑法提取羅非魚頭總脂，通過(guò)硅膠柱層析分離得到磷脂組分TH-PL，其占羅非魚頭干質(zhì)量的1.52%；通過(guò)TLC和FTIR法鑒定確認(rèn)，其具有磷脂的基本性質(zhì)與結(jié)構(gòu)；氣相色譜分析結(jié)果顯示，TH-PL含有豐富的PUFA，約占總脂肪酸含量的38%。采用RAW264.7細(xì)胞在體外成功建立破骨細(xì)胞模型，并利用上述模型確認(rèn)TH-PL具有顯著抑制RAW264.7分化為破骨細(xì)胞的作用。進(jìn)一步研究表明，TH-PL可破壞破骨細(xì)胞線粒體膜完整性，降低線粒體跨膜電位，并提高細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)量，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，當(dāng)TH-PL質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，破骨細(xì)胞總凋亡率達(dá)到24.17%。

綜上所述，本研究制備的TH-PL在一定質(zhì)量濃度下具有顯著抑制破骨前體細(xì)胞分化和促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡的作用，有望成為抑制骨質(zhì)疏松作用的功能性食品原料。