劉南海， 黃曉峰， 符雪濤， 王振鳳， 薛壽儒△， 楊凱

1贛南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(江西贛州 341600)； 贛南醫(yī)學(xué)院 2護(hù)理學(xué)院， 4研究生院， 5藥學(xué)院(江西贛州 341000)； 3蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(江蘇蘇州 215000)

β-淀粉樣蛋白(Aβ)是一種導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)和老年斑的重要組成成分之一，主要在大腦內(nèi)富集，會(huì)引起神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及由凋亡引起的區(qū)域性神經(jīng)細(xì)胞死亡[1]。同時(shí)對(duì)腦血管造成較大的損傷[2]。AD發(fā)病機(jī)制“Aβ瀑布理論”認(rèn)為“Aβ在腦組織中的沉積是腦神經(jīng)元變性及癡呆的起始事件”，Aβ在腦組織中沉積減少，或防治Aβ對(duì)腦神經(jīng)元及血管的損害，則可以起到延緩及減輕AD發(fā)生與進(jìn)展的作用。包括基因?qū)W在內(nèi)的諸多方面的證據(jù)有力佐證該理論，并得到了大多數(shù)學(xué)者專家的認(rèn)可[3]。人參皂苷是一種名貴藥材，其有效成分包括：人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2等[4]。人參皂苷具有較好的抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、提高免疫力、減少細(xì)胞腫脹等作用[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了人參皂苷可以有效減輕腎、腦等臟器缺血再灌注損傷，同時(shí)能有效地保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[6-7]。本課題組的前期研究中也觀察到人參果皂苷對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[8]。王永生等[9]發(fā)現(xiàn)了人參皂苷Rg1對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶MPTP誘導(dǎo)的急性帕金森病小鼠中腦黑質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)作用。有研究表明，人參皂苷Rg1通過(guò)增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，減少心肌纖維化，保護(hù)心臟，可能涉及PI3K/Akt信號(hào)通路和抑制p38MAPK信號(hào)通路[[10]。但人參皂苷Rg1、Rb1對(duì)Aβ誘導(dǎo)的血管損傷是否有保護(hù)作用，最終起到延緩AD的發(fā)生與進(jìn)展，尚未知曉。斑馬魚是脊椎動(dòng)物，有獨(dú)立的組織器官，其器官與人器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面驚人地相似。斑馬魚容易大規(guī)模飼養(yǎng)，雌魚每周產(chǎn)卵1次，每次有幾百個(gè)。Flk-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因整體模型，可以在多孔板中觀察斑馬魚胚胎的血管生成發(fā)育過(guò)程，從而能直接地研究血管形成過(guò)程和形狀的調(diào)控。2016年1月至2019年6月，本研究以轉(zhuǎn)基因斑馬魚為模型，探討人參皂苷Rg1、Rb1抗Aβ血管損害作用，以期了解人參皂苷Rg1、Rb1對(duì)Aβ血管損害保護(hù)作用機(jī)制，從而為AD的防治探索新的路徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)斑馬魚血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Flk-1)由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試劑與儀器 人參皂苷Rg1、Rb1(貨號(hào)：GD-GSJ125-585；純度>98%)購(gòu)自上海古朵生物科技有限公司；胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)試劑盒子購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒子購(gòu)自上海撫生科研有限公司；Aβ、蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Smad2、Smad3抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；VEGF抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建立模型 參考斑馬魚飼養(yǎng)手冊(cè)[11]將健康成熟的斑馬魚按雌雄1∶2的比例放入交配魚缸中，次日搜集雄魚雌魚交配產(chǎn)下的受精胚胎，選取健康的胚胎，使用1 mg/mL的蛋白酶水解去卵膜，取1 g Aβ溶解到20 mL蒸餾水中，使用胚胎水稀釋成25 g/L后滅菌，使用受精20 h的斑馬魚胚胎將配置好的Aβ溶液加入到培養(yǎng)基中每孔20 μL，放在28.5℃的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 分組及藥物干預(yù) 配置20 mg/L的人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1溶液，將孵育出的人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rb1組斑馬魚放入該藥物溶液中處理8 d，對(duì)照組和模型組不使用人參皂苷藥物。

1.3.3 檢測(cè)項(xiàng)目

1.3.3.1 血管長(zhǎng)度和血管面積測(cè)量 使用20×20倍數(shù)顯微鏡對(duì)斑馬魚腸下血管進(jìn)行拍照，使用Image-pro-plus 6.0對(duì)血管面積以像素為劑量單位進(jìn)行定量分析。使用NIH Image圖像處理軟件對(duì)斑馬魚血管長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3.2 SOD、GSH-Px檢測(cè) 建立模型并使用藥物干預(yù)完成后24 h，腹主動(dòng)脈取血分離血清，保存在-20℃條件下待測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SOD、GSH-Px含量。

1.3.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 處死斑馬魚，灌注固定后取動(dòng)脈血管組織樣本，使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測(cè)蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，作圖軟件采用GraphPda Prism5，方差分析使用單因素方差分析，使用單因素方差分析時(shí)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血管長(zhǎng)度和血管面積比較 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚血管長(zhǎng)度顯著縮短(P<0.05)；與模型組相比，人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rb1組斑馬魚血管長(zhǎng)度均顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚血管面積顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rb1組斑馬魚血管面積顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

項(xiàng)目n血管長(zhǎng)度(μm)血管面積(像素)對(duì)照組151 120.32±70.64 16 086.01±4 520.32 模型組15850.11±45.21?12 045.32±2 514.88?人參皂苷Rg1組151 025.74±25.16△15 002.21±3 689.64△人參皂苷Rb1組151 075.25±29.88△15 302.23±3 583.18△F值6.5410.239P值<0.0010.869

注：*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

注：A：斑馬魚血管長(zhǎng)度；B：斑馬魚血管面積；*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

2.2 各組ROS、SOD、GSH-Px水平比較 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05)，ROS水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rb1組斑馬魚ROS水平顯著降低，SOD和GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

項(xiàng)目nROS(U/mL)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)對(duì)照組151.90±0.122.25±0.15142.20±10.11模型組155.75±0.57?0.90±0.10?57.50±7.54?人參皂苷Rg1組153.75±0.49△1.90±0.11△132.21±8.21△人參皂苷Rb1組153.81±0.27△1.55±0.35△123.12±7.52△F值227.352119.09327.280P值<0.001<0.001<0.001

注：*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

注：A：各組SOD水平比較；B：各組ROS水平比較；C：各組GSH-Px水平比較；*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

圖2各組ROS、SOD、GSH-Px水平比較

2.3 各組相關(guān)蛋白比較 與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rb1組斑馬魚VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

3 討論

AD是一種進(jìn)行性記憶受損及認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，病變損傷與認(rèn)知功能關(guān)系密切的腦區(qū)，最常見(jiàn)部位包括顳葉內(nèi)側(cè)，尤其是海馬部位、頂葉和額葉。有不少學(xué)者利用質(zhì)子磁共振波譜技術(shù)對(duì)AD及認(rèn)知功能障礙進(jìn)行早期診斷[12]，但是AD發(fā)病機(jī)制方面的研究尚未取得突破性進(jìn)展，AD的防治仍是亟待解決的重大課題。近些年來(lái)，許多研究者在AD動(dòng)物模型及AD患者中發(fā)現(xiàn)腦血管功能障礙與AD發(fā)病的密切關(guān)系，認(rèn)為腦內(nèi)血管功能的異常導(dǎo)致Aβ清除能力降低并加重神經(jīng)元的功能損害，進(jìn)而導(dǎo)致AD的發(fā)病與病情的進(jìn)展[13-14]。

項(xiàng)目nVEGFTGF-β1Smad2Smad3對(duì)照組151.69±0.150.47±0.160.55±0.220.76±0.25模型組150.38±0.18?1.69±0.18?1.59±0.25?1.57±0.19?人參皂苷Rg1組151.37±0.16△1.22±0.17△1.04±0.26△1.33±0.21△人參皂苷Rb1組151.49±0.18△0.98±0.18△0.86±0.25△1.24±0.18△F值285.277 307.811 142.316 103.504P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

注：*與對(duì)照組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05

人參皂苷Rg1、Rb1是從人參根莖中提取的水溶性成分。向玥等[15]研究表明,人參皂苷Rg1、Rb1對(duì)氧化物的產(chǎn)生具有抑制作用，可以有效緩解氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)邱詠園等[16]研究證明,人參皂苷Rg1、Rb1制氧自由基的產(chǎn)生和清除氧自由基。Aβ在血管內(nèi)會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使得血管局部產(chǎn)生單態(tài)氧，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮，活化白細(xì)胞和血小板進(jìn)而活化纖維蛋白原，形成血栓并破壞血管甚至導(dǎo)致血管的硬化和破裂[17-18]。ROS 的大量堆積是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的重要機(jī)制之一[19-20]。有研究表明，在健康的細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但是在氧化應(yīng)激情況下，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS并破壞線粒體膜和細(xì)胞膜的完整性，使上皮細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶SOD、GPX等酶的大量釋放[21]。因此，ROS 損傷被認(rèn)為是引起細(xì)胞氧化損傷的主要機(jī)制?？寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩大類，酶體系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反應(yīng)氧化應(yīng)激的程度[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，模型組斑馬魚SOD和GSH-Px水平顯著降低，ROS水平顯著升高。說(shuō)明模型組斑馬魚血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激較為嚴(yán)重，其血管損傷嚴(yán)重。使用人參皂苷Rg1和Rb1處理后，斑馬魚ROS水平顯著降低，SOD和GSH-Px水平顯著升高說(shuō)明斑馬魚血管內(nèi)氧化應(yīng)激得到了顯著的抑制。這可能是因?yàn)槿藚⒃碥誖g1和Rb1中存在抗氧化物質(zhì)，這種抗氧化物質(zhì)可以降低提升氧化酶活力，提高了斑馬魚機(jī)體的抗氧化能力，并抑降低細(xì)胞膜的通透性，抑制細(xì)胞內(nèi)酶SOD、GPX等酶的大量釋放到細(xì)胞外導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷。陳洪娜等[23]研究表明,抑制血管內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)可以有效降低血管的損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

TGF-β1家族可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)緩解血管損傷，同時(shí)TGF-β1活化能夠促進(jìn)多種疾病的產(chǎn)生和發(fā)展，其中包括血管疾病及多種器官的漸進(jìn)性纖維化等[24]。Smads家族是TGF-β1家族的下游基因，目前發(fā)現(xiàn)的Smads家族蛋白有9種，Smad1～9，其中Smad2和Smad3可以被其上游的TGF-β1家激活，刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及纖連蛋白的合成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，模型組斑馬魚VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明斑馬魚血管的增殖受到了Aβ的抑制，導(dǎo)致其增殖及發(fā)育的不完全。同時(shí)研究中也發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，模型組斑馬魚血管長(zhǎng)度顯著降低，也證明了Aβ可以抑制血管的生長(zhǎng)及發(fā)育，并導(dǎo)致其萎縮。使用人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1處理后斑馬魚VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高，TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低。說(shuō)明血管的生長(zhǎng)受到了顯著的促進(jìn)。這可能是因?yàn)門GF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白主要表達(dá)于新生內(nèi)膜處，通過(guò)該通路對(duì)血管內(nèi)膜的增殖有一定的促進(jìn)作用，并使得血管平滑肌增殖，防止Aβ導(dǎo)致的血管萎縮及發(fā)育不良。研究表明，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路達(dá)到調(diào)節(jié)血管內(nèi)平滑肌的增殖的作用。

綜上所述，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1可以減輕Aβ導(dǎo)致的損傷，有效保護(hù)血管，其作用機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)平滑肌的增殖和血管的發(fā)育有關(guān)。加之人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，故有可能成為防治AD發(fā)病與進(jìn)展一條新的途徑。本研究涉及到的模型樣本數(shù)量較少，在后期的研究中將進(jìn)一步增加研究的樣本數(shù)量并增加人參皂苷中國(guó)不同的有效成分，設(shè)置更多濃度梯度進(jìn)行對(duì)比。