黎國德， 許慶波， 韓克棟

茂名市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東茂名 525000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病又稱為冠心病，是由于機體脂質代謝異常，在血液中形成的脂質會沉積于動脈內(nèi)膜上，逐漸累積形成類似于粥樣脂類物質的白色斑塊，隨后引起血管腔狹窄或者阻塞，從而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者壞死，最終導致心臟病[1-2]。在臨床上常常將冠心病分為慢性心肌缺血綜合征(又稱為穩(wěn)定性冠心病)和急性冠狀動脈綜合征兩種[3]。據(jù)2017年全球疾病負擔國際合作研究報道，冠心病是全球病死率最高的疾病，多發(fā)于中老年人，且男性患者多于女性，已成為全球各個國家最常見的病種之一[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球冠心病的患者人數(shù)已高達1.1億，每年死于冠心病的人數(shù)接近900萬。而在我國，從近期中國疾病預防控制中心的研究報告顯示，隨著老齡化進程的加劇，我國冠心病的發(fā)病和死亡人數(shù)在不斷增加，已成為我國病死率最高的疾病之一[1,4]。有研究表明，冠心病主要的發(fā)病機制是冠脈血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，形成白色斑塊，隨后出現(xiàn)斑塊潰瘍、破裂以及血小板黏附聚集等，導致血栓形成，心肌缺血等[5]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，冠心病的危險因素包括高齡、吸煙、高血壓、血脂異常、糖尿病、高總膽固醇(total cholesterol，TC)等，其中高血壓是冠心病的主要危險因素，隨著患者血壓的升高，冠心病的發(fā)病率和病死率均呈現(xiàn)上升的趨勢[6-7]。氯吡格雷是一種P2Y12受體拮抗劑，需要經(jīng)過肝臟P450酶代謝產(chǎn)生活化物質后，才能選擇性不可逆地抑制血小板ADP受體，從而阻斷P2Y12依賴激活的血小板膜糖蛋白復合物，減少ADP介導的血小板激活和聚集[8-9]。氯吡格雷的半衰期是6 h，常規(guī)劑量的起效時間為2～8 h，常常與阿司匹林聯(lián)合使用，主要用于心肌梗死患者[1, 10-11]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)主要存在于肝臟組織中，是肝臟代謝過程中的關鍵酶[12]。MTHFR主要位于染色體 1p 36.3，有20多種基因突變位點，其中以C677T 和 A1298C 位點最為常見，而C677T基因型主要是C/T發(fā)生突變從而引起酶活性和功能的改變，A1298C基因型則是A/C發(fā)生突變后可能會影響酶的功能，進而影響藥物在機體的吸收和代謝[13-14]。因此，本研究擬通過研究MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性與冠心病合并高血壓患者氯吡格雷耐受的相關性，為不同MTHFR基因型的冠心病患者提供更為合理的治療方案，增強臨床療效和個性化用藥提供一定的科學理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年1月在本院接受診治的95例冠心病患者，其中合并高血壓(GC組)的患者50例，男27例，女23例，年齡為(61.7±9.4)歲，體質指數(shù)(BMI)(27.7±3.9)kg/m2；不合并高血壓(C組)的患者45例，男21例，女24例，年齡為(61.4±10.1)歲，BMI(28.1±3.6)kg/m2。兩組患者年齡、性別、BMI等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。入組標準：經(jīng)冠狀動脈造影提示冠狀動脈狹窄≥50%，確診為冠心病，包括慢性冠心病和急性冠脈綜合征的患者；依據(jù)2014年中國高血壓防治指南診斷為高血壓，即每隔2周測量1次，連續(xù)血壓收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg的患者；無嚴重肝腎等重要器官功能不全的患者。剔除標準：既往口服過氯吡格雷的患者；繼發(fā)性高血壓患者；近期有嚴重出血史、造血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病的患者。

1.2 主要試劑與儀器 引物合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)；全血DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；限制性內(nèi)切酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Taq DNA聚合酶(Takara)；化學試劑均為分析純(廣州市西隴化工有限公司)等。PCR擴增儀(杭州博日科技有限公司)；Maestro GEN超微量分光光度儀(美國Maestro公司)等。

1.3 治療方案與觀察指標 所有患者都采用聯(lián)合口服75 mg氯吡格雷[賽諾菲(杭州)制藥有限公司]和100 mg阿司匹林(拜耳醫(yī)藥有限公司)進行治療，同時口服單硝酸異山梨酯(魯南貝特制藥有限公司)等常規(guī)藥物。于入院后第2天和服藥后第6天用二磷酸腺苷專用抗凝管采集大約5 mL的靜脈血，檢測血小板抑制率，同時于次日清晨抽取2 mL的靜脈血，進行血常規(guī)檢測，3 mL的靜脈血檢測肝腎功能、血脂等指標；然后取部分靜脈血用于全血DNA的提取。

入院前記錄患者的一般資料(姓名、性別、年齡、身高、體重等)，既往服藥情況，入院后進行血常規(guī)檢測、肝腎功能檢測、血脂檢測[包括三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等]。觀察兩組患者MTHFR基因多態(tài)性分布特點以及各基因型的比例，分析兩組不同基因型患者與口服氯吡格雷耐受性的相關性。

1.4 全血DNA的提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒并嚴格按照說明書提取兩組患者的血樣DNA，隨后通過Maestro GEN超微量分光光度儀檢驗提取的DNA的純度。

1.5 基因型分析 通過聚合酶鏈式反應(PCR)和限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)法(PCR-RFLP)分析MTHFR基因型?；蛎Q及其引物序列見表1。94℃下解鏈5min，隨后94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共35個循環(huán)；然后在72℃下再延伸5 min，1個循環(huán)。

表1 基因名稱及其引物序列

2 結果

2.1 一般資料的比較 兩組患者的血常規(guī)、TC、TG、HDL和LDL等差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組患者基因型分布特征比較 經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC組中，MTHFR C677T的CT基因型突變的頻率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突變頻率最低，T等位基因的頻率高達68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突變頻率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突變頻率最低，A等位基因的頻率高達82.3%。在C組中，MTHFR C677T中各基因型的突變頻率與GC組類似，CT>TT>CC，T等位基因的頻率為64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突變頻率也與GC組差不多，AA>AC>CC，A等位基因的頻率為78.4%。兩組患者各基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同基因型分布特征見表3。

項目例數(shù)吸煙史[例(%)]飲酒史[例(%)]TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)GC組5014(28.0)21(42.0)1.86±0.744.24±1.411.21±0.512.53±1.03C組4511(24.4)18(40.0)1.64±0.814.06±1.331.10±0.892.26±0.942/t值0.3470.2161.3542.1533.1140.984P值0.5810.2270.1840.0870.2690.131

表3 兩組患者MTHFR各基因型分布特征及等位基因頻率比較 例(%)

2.3 不同基因型患者氯吡格雷耐受情況比較 在本研究中，GC組患者有50例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C組患者有45例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，兩組患者在氯吡格雷耐受性比率上的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是，不管是GC組還是C組，MTHFR C677T的CT基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率明顯高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而MTHFR A1298C三種基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

3 討論

隨著社會老齡化進程的加劇，全球范圍內(nèi)冠心病的發(fā)病率和病死率都在不斷升高，已經(jīng)成為了全球病死率最高的疾病，嚴重威脅著全世界人民的生命健康[1-2]。據(jù)研究表明，冠心病的危險因素主要有年齡、吸煙、高血壓、血脂異常、糖尿病、總膽固醇等，其中高血壓是冠心病的主要危險因素，隨著患者血壓的升高，冠心病的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升的趨勢[15]。一般來說，冠狀動脈病變的狹窄程度和部位將決定患者缺血癥狀和預后情況，當管腔狹窄<50%時，心肌供血并不會受到太大的影響，當管腔狹窄>50%時，運動、心動過速或者激動都會引起心臟耗氧量升高，進而引起短暫性的心肌供血不足，導致慢性穩(wěn)定性心絞痛，而當粥樣斑塊發(fā)生破裂、糜爛或者出血時，就容易形成血栓，進而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者壞死，引發(fā)急性心肌梗死[16-17]。因此，為了能夠更好地控制冠心病的發(fā)病率和死亡率，尋找更加合理的治療方案，構建個體化用藥和精準醫(yī)學的體系，全球相關臨床和科研人員都致力于探究不同患者應用不同藥物治療冠心病的作用機制，期望更好地提高藥物的臨床療效。

表4 不同基因型患者對氯吡格雷耐受性的影響

氯吡格雷是《冠心病合理用藥指南(第2版)》中主要用于預防心肌梗死和改善預后的一種常用藥物[1]，它是一種P2Y12受體拮抗劑，需要經(jīng)過肝臟P450酶代謝產(chǎn)生活化物質后，才能選擇性不可逆地抑制血小板ADP受體，從而阻斷P2Y12依賴激活的血小板膜糖蛋白復合物，減少ADP介導的血小板激活和聚集[8, 18]。雖然氯吡格雷治療冠心病的臨床療效是毋庸置疑的，但是它最大的缺點就是存在較大的個體差異，導致有一部分的患者無法獲得較好的治療效果，反而出現(xiàn)氯吡格雷抵抗，甚至是卒中等不良事件，堪稱一把冠心病的“雙刃劍”[11, 19-20]。張惠娟等[21]通過觀察高血壓合并冠心病患者應用氨氯地平、氨氯地平聯(lián)合氯吡格雷的臨床治療效果，發(fā)現(xiàn)氯吡格雷聯(lián)合氨氯地平用于治療高血壓病合并冠心病，能夠明顯提高臨床療效和改善心功能。而劉炳博等[22]通過對冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈支架植入術 (PCI)后氯吡格雷發(fā)生抵抗的因素進行分析發(fā)現(xiàn)，高齡、 糖尿病、高血壓和慢性腎臟病等都會使患者出現(xiàn)氯吡格雷抵抗的情況，需要給予替代藥物來降低缺血事件引起大風險，改善PCI的預后情況。Savonitto等[23]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)老年患者在急性冠脈綜合征后發(fā)生缺血和出血并發(fā)癥的風險明顯高于年輕患者，并且表現(xiàn)出更高的氯吡格雷血小板反應性。因此，在臨床應用氯吡格雷的時候需要進行全方位的判斷和分析，以便更好地提高臨床療效的同時，減少不良事件的發(fā)生。

Wang等[2]通過監(jiān)測不同患者GP89基因多態(tài)性與冠心病、血脂、血糖和血壓的變化，發(fā)現(xiàn)GP89基因145位點發(fā)生突變后能夠顯著影響患者血脂、血糖、血壓等指標，從而影響冠心病的預后情況，該研究表明影響冠心病的臨床療效還可能是與不同患者基因型發(fā)生了突變有關。已有研究[24]發(fā)現(xiàn)，MTHFR主要存在于肝臟組織中，是肝臟代謝過程中的一種關鍵酶。MTHFR主要位于染色體 1p36.3，主要由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，編碼區(qū)序列長2.2 kb，研究[13]發(fā)現(xiàn)其5′端非編碼區(qū)經(jīng)常會發(fā)生選擇性剪接，且MTHFR有20多種基因突變位點，表明MTHFR基因存在表達上的復雜性。其中以C677T 和 A1298C 位點最為常見，在不同國家、不同地區(qū)和不同個體中，C677T 和 A1298C 位點的基因型分布具有顯著的差異。MTHFR C677T基因型主要是C/T發(fā)生突變從而引起酶活性和功能的改變，而A1298C基因型則是A/C發(fā)生突變后可能會影響酶的功能，進而影響藥物在機體的吸收和代謝[25]。Zhu等[26]通過觀察和分析甲氨蝶呤與不同兒童惡性腫瘤患者MTHFR基因多態(tài)性的相關性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T多態(tài)性的基因分型可能是減少毒性和改善個性化甲氨蝶呤治療的重要依據(jù)。而在冠心病的治療方面，MTHFR作為血漿同型半胱氨酸(Hcy)代謝過程中的關鍵酶，可以通過催化N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原成 N5-甲基四氫葉酸，然后促使Hcy再甲基化形成蛋氨酸，以維持Hcy的正常血漿水平，預防冠心病的發(fā)生和發(fā)展，而當MTHFR C677T基因型中C等位基因突變成T等位基因時，會導致丙氨酸被纈氨酸所取代，進而促使酶活性降低，引起血漿中Hcy的水平顯著提高，最終加劇冠心病的進展[27-29]。還有研究[30-31]通過觀察分析MTHFR C677T基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓患者粥樣硬化斑塊形成的相關性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677位點C等位基因突變成T等位基因，有可能會增加老年高血壓患者粥樣斑塊形成的風險。

本研究選取了95例冠心病患者，其中合并高血壓(GC組)的患者50例，不合并高血壓(C組)的患者45例，兩組患者的血常規(guī)、TC、TG、HDL和LDL等指標以及年齡、性別、BMI、飲酒、吸煙等差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，排除了冠心病其他危險因素對氯吡格雷耐受的影響。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC組中，MTHFR C677T的CT基因型突變的頻率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突變頻率最低，T等位基因的頻率高達68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突變頻率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突變頻率最低，A等位基因的頻率高達82.3%。在C組中，MTHFR C677T中各基因型的突變頻率與GC組類似，CT>TT>CC，T等位基因的頻率為64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突變頻率也與GC組差不多，AA>AC>CC，A等位基因的頻率為78.4%。兩組患者各基因型之間的差異并沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明MTHFR C677T和MTHFR A1298C是否發(fā)生突變與冠心病是否合并高血壓之間沒有直接關系。隨后，本研究發(fā)現(xiàn)GC組患者50例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C組患者45例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，兩組患者在氯吡格雷耐受性比率上的差異并沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是，不管是GC組還是C組，MTHFR C677T的CT基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率明顯高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明當MTHFR C677T患者的C等位基因突變?yōu)門等位基因后，患者對氯吡格雷耐受的幾率明顯升高，MTHFR C677T的CT基因型可能是導致氯吡格雷耐受的主要遺傳因素。而MTHFR A1298C患者的三種基因型中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明MTHFR A1298C與患者出現(xiàn)氯吡格雷耐受可能并無直接關系。

本研究提示，MTHFR C677T的C/T發(fā)生基因突變后，可能會不同程度地影響冠心病合并高血壓患者對氯吡格雷的耐受性，而MTHFR A1298C發(fā)生基因突變后可能并不會影響患者對氯吡格雷的耐受性，這可能是因為MTHFR基因表達或突變會被機體不同的因素所調(diào)控。這結果提示我們不同個體之間存在不同的基因型分布特征，在使用藥物時不僅要考慮個體疾病的復雜性和交叉性，還需要不同個體基因型的特征，才能夠更好地提供治療方案，提高臨床療效?；诂F(xiàn)有研究成果上，后續(xù)將對不同地區(qū)、不同生活習慣和環(huán)境的患者進行區(qū)分和觀察分析，并進一步擴大樣本量，增加對氯吡格雷耐受的評價指標和因素，以期提供更為合理更為準確的臨床數(shù)據(jù)，為構建個性化治療體系提供更多的科學依據(jù)。