王云龍 李 果 李玉林 王繼創(chuàng) 程 蕾 張怡青

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453002)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高，并呈年輕化趨勢(shì)[1]。早診斷、早發(fā)現(xiàn)，對(duì)乳腺癌患者及時(shí)進(jìn)行有效的治療和預(yù)后具有重要意義。2007年美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)將血清糖蛋白抗原CA15-3(breast cancer antigen,CA15-3)推薦為初級(jí)治療后乳腺癌患者的篩查、診斷、分期或常規(guī)監(jiān)測(cè)的一種重要腫瘤標(biāo)志物[2]，王燕敏等[3]的研究表明CA15-3的特異性為75%，敏感性為55.89%，其特異性及敏感性都不太理想。周巖等[4]、魏蓉[5]的研究結(jié)果顯示人附睪蛋白4 (human epididymis protein 4，HE4)在正常細(xì)胞中低表達(dá)，而在乳腺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)。乳腺癌患者和乳腺良性腫瘤患者血清HE4水平與血清CA15-3水平均呈正相關(guān)[6-8]，HE4和CA15-3聯(lián)合檢測(cè)有助于乳腺癌的輔助診斷[6,9-13]，其檢出率可高達(dá)92.5%[6]，明顯提高乳腺癌臨床診斷的效果，HE4與CA15-3聯(lián)合檢測(cè)能夠更好地指示乳腺癌的發(fā)展變化。聯(lián)合檢測(cè)成為近年來研究的熱點(diǎn)，但臨床上未見CA15-3與HE4聯(lián)合檢測(cè)熒光免疫層析的產(chǎn)品，本研究初步建立了聯(lián)合檢測(cè)HE4、CA15-3熒光免疫層析的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 PVC板購自上海良信生物科技有限公司，吸水紙、玻璃纖維棉購自通城印刷廠，硝酸纖維素膜(CN-140)購自德國Sartorius，基質(zhì)血清、臨床定值血清樣本由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2試劑 碳化二亞胺(EDC)購自生工生物工程(上海)有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自深圳海王英特龍生物有限公司，羧基修飾時(shí)間分辨熒光微球(固含量1%)、HE4配對(duì)單克隆抗體、CA15-3配對(duì)單克隆抗體、鼠抗兔單抗、兔多抗IgG，HE4線性質(zhì)控品(3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500、1 000、1 500、2 000 pmol/L)、CA15-3線性質(zhì)控品(0.97、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 U/ml)、HE4精密性質(zhì)控品(50、150、300 pmol/L)、CA15-3精密性質(zhì)控品(20、80、200 U/ml)、特異性質(zhì)控品(CA12-5 300 U/ml、CA19-9 300 U/ml、CEA 50 ng/ml)均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop One型)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；臺(tái)式恒溫振蕩器(THZ-92B型)購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；熒光免疫層析讀數(shù)儀購自杭州峰航科技有限公司；紫外分析儀(JY03型)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)(H1850)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；三維噴金點(diǎn)膜儀、微電腦自動(dòng)斬條機(jī)購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫微球、免疫微球墊包被板的制備 取800 μl 0.05 mol/L，pH=8.0硼酸鹽緩沖液(下同)，加入10 μl的熒光微球，1 mg/ml的EDC和NHS各40 μl，室溫振蕩活化30 min后；15 000 r/min離心30 min，棄上清，加入1 000 μl 硼酸鹽緩沖液中，重懸微球，加入20 μg標(biāo)記抗體，室溫低速振蕩偶聯(lián)2 h 后；12 000 r/min離心30 min，棄上清，加入1 500 μl 復(fù)溶液，使已偶聯(lián)抗體的微球均勻重懸，加入20 μl 10%BSA，混勻，室溫低速振蕩封閉30 min，完成免疫微球的制備，密封避光4℃保存?zhèn)溆?。按照以上方法分別標(biāo)10 μg、40 μg、30 μg標(biāo)記抗體制得兔多抗IgG、HE4單克隆標(biāo)記抗體和CA15-3單克隆標(biāo)記抗體的微球。在三維平面點(diǎn)膜噴金儀上，將制備好的兔多抗IgGHE4標(biāo)記抗體和CA15-3標(biāo)記抗體，免疫微球等體積混合后，均勻噴涂到已處理且烘干后的微球結(jié)合墊上，37℃，干燥10 h后，密封避光4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谌S平面點(diǎn)膜噴金儀上，將鼠抗兔單抗、HE4單克隆包被抗體、CA15-3單克隆包被抗體稀釋至2.0 mg/ml、3.0 mg/ml和2.0 mg/ml，包被于PVC板的NC膜中央位置上，作為質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T1線、T2線)，37℃，干燥2 h后，密封避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2試紙條的組裝 將吸水紙、免疫微球墊、包被板、樣品墊依次按圖1所示，組合到包被板上，用微電腦自動(dòng)斬條機(jī)切成3.9 mm寬的試紙條,密封避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 試紙條組裝示意圖Fig.1 Schematic diagram of test strip assembly

1.2.3樣本的檢測(cè) 取70 μl待測(cè)樣本，滴加在樣品墊上，到達(dá)檢測(cè)時(shí)間后，立即用干式熒光免疫分析儀檢測(cè)，記錄試紙條的C、T線熒光值。將檢測(cè)的結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到樣本濃度值。

1.2.4檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.2.4.1檢測(cè)時(shí)間的確定 取HE4精密性質(zhì)控品、CA15-3精密性質(zhì)控品按照70 μl的加樣量進(jìn)行加樣，分別在加樣后 5、8、10、12、15、18、20 min檢測(cè)試紙條的 C、T 線熒光強(qiáng)度，記錄熒光值，計(jì)算 T/C值。

1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 取HE4線性質(zhì)控品、CA15-3線性質(zhì)控品，滴加在樣品墊上，15 min后，立即用干式熒光免疫分析儀檢測(cè)，各濃度重復(fù)檢驗(yàn)5條，記錄熒光值。

1.2.4.4精密性 隨機(jī)抽取同一批試紙條和三個(gè)不同批次的試紙條，分別用HE4精密性質(zhì)控品、CA15-3精密性控品，進(jìn)行檢測(cè)，各濃度重復(fù)檢驗(yàn)10條，分別計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

1.2.4.5特異性 取HE4 (1 000 pmol/L)和CA15-3 (1 000 U/ml) 質(zhì)控品等體積混合，并將混合液用基質(zhì)血清倍比稀釋，制得最終濃度HE4 250 pmol/L， CA15-3 250 U/ml；HE4 125 pmol/ml，CA15-3 125 U/ml；HE4 62.5 pmol/L，CA15-3 62.5 U/ml；三份待檢測(cè)樣本，重復(fù)檢測(cè)5次，分別計(jì)算其理論值，與真實(shí)值比較。取特異性質(zhì)控品，與含HE4 500 pmol/L，CA15-3 500 U/ml的室內(nèi)質(zhì)控品等體積混合，重復(fù)檢測(cè)5次，分別計(jì)算其理論值，與真實(shí)值比較。

1.3方法學(xué)比較 用所建立的HE4、CA15-3聯(lián)合檢測(cè)試紙條與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢測(cè))平行檢測(cè)60份臨床血清，以聯(lián)合檢測(cè)試紙條檢測(cè)濃度作為橫坐標(biāo)(X軸)，羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)濃度作為縱坐標(biāo)(Y軸)，進(jìn)行線性回歸分析對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)時(shí)間的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、3。由圖可觀察到熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化而增大，14 min后T/C值趨于平穩(wěn)，選擇15 min作為最適檢測(cè)時(shí)間。

圖2 CA15-3最適檢測(cè)時(shí)間結(jié)果Fig.2 Results of CA15-3 best detection time

圖3 HE4最適檢測(cè)時(shí)間結(jié)果Fig.3 Results of HE4 best detection time

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以T/C值平均數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，HE4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.441 5x-1.785 6，R2為0.987 2；CA15-3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.418 2x-2.170 7，R2為0.985 9，見圖4、5。

圖4 HE4 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for HE4

圖5 CA15-3的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for CA15-3

2.3線性范圍與最低檢出限 測(cè)得HE4線性范圍為15.6～1 500 pmol/L，最低檢出限為14.33 pmol/L，CA15-3線性范圍為7.8～500 U/ml，最低檢出限為5.00 U/ml。

表1 批內(nèi)與批間變異系數(shù)Tab.1 Result of coefficient of variation fluorescence immunchromatography

2.5特異性 HE4和CA15-3同時(shí)檢測(cè)，準(zhǔn)確率均在90%以上，見表2，表明該方法同時(shí)檢測(cè)HE4和CA15-3不存在相互干擾。

表2 HE4和CA15-3干擾實(shí)驗(yàn)理論值與真實(shí)值的比較Tab.2 Comparison of theoretical and measured values of HE4 and CA15-3 interference experiments

三種特異性質(zhì)控品的檢測(cè)，準(zhǔn)確率均在90%以上，表明該方法與CA12-5、CA19-9、CEA不發(fā)生交叉反應(yīng)，試劑抗干擾能力較強(qiáng)，見表3。

表3 特異性質(zhì)控品檢測(cè)理論值與真實(shí)值的比較Tab.3 Comparison of theoretical and real values of specific quality control products

2.6方法學(xué)比對(duì) 分別用兩種方法對(duì)60份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6、7所示，兩種檢測(cè)方法的HE4相關(guān)方程為Y=0.924 9x+6.738，R2=0.953；CA15-3相關(guān)方程Y=0.913 5x-0.682 4，R2=0.956 3。表明本方法制備的HE4、CA15-3聯(lián)合檢測(cè)免疫層析試紙條檢測(cè)HE4、CA15-3分別與羅氏電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光法。

圖6 HE4熒光免疫層析法與電化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between HE4 fluorescence immunochromatography and electrochemiluminescence

圖7 CA15-3熒光免疫層析法與電化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between CA15-3 fluorescence immunochromatography and electrochemiluminescence

3 討論

一種腫瘤標(biāo)記物含量的變化可出現(xiàn)在多種腫瘤內(nèi)，一種腫瘤的發(fā)展也可以有多種標(biāo)記物含量的變化[14]。表現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物、腫瘤的非特異性。由于檢測(cè)單一的腫瘤標(biāo)志物的結(jié)果并不理想，聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)腫瘤標(biāo)志物來提高靈敏度、準(zhǔn)確度等檢測(cè)指標(biāo)，為診斷提供更有力的支撐。腫瘤標(biāo)記物在乳腺癌診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)以及治療效果的評(píng)估方面發(fā)揮廣泛的作用。CA15-3是乳腺癌常用的腫瘤標(biāo)志物，近年發(fā)現(xiàn)HE4在乳腺癌癥診斷方面也發(fā)揮重要作用[15]。雖然張藝等[16]和吳英松等[17]利用 Eu3+作為標(biāo)記物、96孔板作為固相載體建立了單獨(dú)檢測(cè) HE4和CA15-3時(shí)間分辨熒光免疫分析的方法，但該方法需進(jìn)行洗滌等一系列繁瑣的操作步驟，檢測(cè)時(shí)間長，不適應(yīng)床旁快速檢測(cè)。羅朝領(lǐng)等[18]申請(qǐng)了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試劑的專利，未表明其檢測(cè)方法的性能指標(biāo)，而且除了試紙條外，還需要反應(yīng)檢測(cè)杯，增加了產(chǎn)品成本，也不利于推廣應(yīng)用。

本研究用雙抗體夾心法與熒光免疫層析技術(shù)相結(jié)合的方法，建立了基于時(shí)間分辨熒光免疫層析的雙組分聯(lián)合檢測(cè)方法，具有一次檢測(cè)，高靈敏、短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種標(biāo)志物，且互不干擾的特點(diǎn)。其原理為血清中的待測(cè)標(biāo)志物，在層析作用下,與免疫微球微球墊上的各自微球標(biāo)記單抗結(jié)合，形成其“熒光微球-抗體-抗原”復(fù)合物,在硝酸纖維素膜的虹吸作用下，經(jīng)過包被膜，與膜上各自的配對(duì)單抗結(jié)合,15 min 后檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)HE4、CA15-3定量檢測(cè)。在優(yōu)選實(shí)驗(yàn)條件下，HE4在15.6～1 500 pmol/L范圍內(nèi)，成線性相關(guān)，最低檢出限為14.33 pmol/L，CA 15-3在7.8～500 U/ml范圍內(nèi)，成線性相關(guān)，最低檢出限為5.00 U/ml，相關(guān)系數(shù)均大于0.98。批內(nèi)精密性與批間精密性均小于15%，與常見的腫瘤標(biāo)志物 (CA12-5、CA19-9、CEA) 均無交叉反應(yīng)，CA15-3與HE4兩組分同時(shí)檢測(cè)無交叉干擾，準(zhǔn)確度均在90%以上；與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，相關(guān)系數(shù)均在95%以上。臨床上HE4、CA15-3檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫法和電化學(xué)發(fā)光法，未出現(xiàn)關(guān)于HE4和CA15-3聯(lián)檢的熒光免疫層析的產(chǎn)品。這兩種方法檢測(cè)時(shí)間較長，配套檢測(cè)儀器昂貴并且要求專業(yè)人員操作，不利于在基層和社區(qū)醫(yī)院廣泛推廣使用。本研究建立了一種精密性好、簡便、快速、能滿足床旁快速定量檢測(cè)的HE4、CA15-3熒光免疫層析聯(lián)合檢測(cè)方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步研究將增加生產(chǎn)批次，研究其穩(wěn)定性，加大檢測(cè)的樣本數(shù)量，為其應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。