富文達(dá) 朱俊豐 喬 麗 孫 遜

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽 110122)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腸道炎癥性疾病，根據(jù)臨床表現(xiàn)可以分為潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)[1]。IL-1家族在IBD發(fā)病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[2]。IL-36亞家族包括IL-36α(IL-1F6)、IL-36β(IL-1F8)、IL-36γ(IL-1F9)和IL-36Ra(IL-1F5)，是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員[3]。IL-36α廣泛表達(dá)于角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中，提示IL-36α在相關(guān)組織的穩(wěn)態(tài)和炎癥中發(fā)揮重要作用[4,5]。小鼠IL-36α基因共編碼160個氨基酸(Met-1-His-160)，分子量約為17 kD。已有研究證明，在N端去除短結(jié)構(gòu)域形成的IL-36α成熟肽(Arg-8-His-160)可以將IL-36α全蛋白的活性提高多達(dá)1 000倍[6]。目前關(guān)于IL-36α在IBD中的作用研究還處于起步階段，在臨床IBD患者腸組織和小鼠IBD模型腸黏膜中，IL-36α的表達(dá)水平顯著升高[7,8]，提示IL-36α可能在IBD發(fā)病中發(fā)揮作用。目前，還未有關(guān)于重組小鼠IL-36α成熟肽制備及應(yīng)用的相關(guān)報道，本研究利用原核表達(dá)的方法制備小鼠IL-36α成熟肽，并對其在IBD發(fā)病中的作用進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究IL-36的腸道黏膜免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 質(zhì)粒pET28a(+)、大腸埃希菌(Escheri-chia coli)BL21(DE3)由中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室保存。小鼠IL-36α成熟肽基因委托武漢金開瑞生物工程有限公司優(yōu)化合成。C57BL/6雄性小鼠(6～8周，SPF級)購于北京維通利華有限公司。DNA Maker、2×Pfu master Mix、T4DNA連接酶、瓊脂糖電泳回收試劑盒、IPTG、卡那霉素、Ni-Aganose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、ToxinEraserTM內(nèi)毒素去除試劑盒、ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司、小鼠抗His-Tag單克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司、DSS購自美國MP Biomedicals公司。

1.2方法

1.2.1pET28a-IL-36α質(zhì)粒構(gòu)建 對小鼠IL-36α基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，合成優(yōu)化后的小鼠IL-36α成熟肽基因。將IL-36α與pET28a(+)質(zhì)粒載體分別用NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后連接，構(gòu)建pET28a-IL-36α質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，菌落PCR鑒定并測序，上述工作委托武漢金開瑞生物工程有限公司完成。

1.2.2小鼠IL-36α成熟肽的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組小鼠IL-36α成熟肽工程菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；次日，按2%比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、210 r/min培養(yǎng)2 h，至OD600值達(dá)到0.6時，加入終濃度為0.7 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為：溫度16℃或20℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，時間20 h，將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心，除去上清，收集菌體。

1.2.3小鼠IL-36α成熟肽的純化 誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體用PBS重懸，將獲得的菌體采用超聲破碎法裂解，離心收集上清液，使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，pH7.9)清洗柱子，目的是去除雜蛋白。再用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液(咪唑濃度：50 mmol/L，100 mmol/L，150 mmol/L，200 mmol/L，300 mmol/L) 洗脫，收集蛋白，將收集的蛋白使用ToxinEraserTM內(nèi)毒素去除試劑盒去除內(nèi)毒素，經(jīng)ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測rIL-36α溶液的內(nèi)毒素濃度小于0.5 Eu/ml，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4蛋白免疫印跡(Western blot)分析 分別將目的蛋白及對照組蛋白經(jīng)處理后進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，利用轉(zhuǎn)移電泳儀將電泳分離的蛋白膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉過夜，PBST洗膜3次，加2 000倍稀釋的小鼠抗His-Tag單克隆抗體在雜交袋中雜交1 h后，PBST洗膜5次，每次10 min,加入5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫雜交1 h，PBST洗膜5次，每次10 min，然后在PVDF膜上加入Western發(fā)光檢測液A、B各50 μl，放入暗室里進(jìn)行顯影反應(yīng)。

1.2.5DSS腸炎模型建立 實驗小鼠給予2.5%的DSS飲用水直至小鼠體重降至80%以下。每日觀測小鼠腸炎發(fā)病進(jìn)展，檢測小鼠體重、血便、下痢和生存率。

1.2.6重組IL-36α成熟肽干預(yù)DSS腸炎模型 實驗組：在飲用DSS溶液的同時，腹腔注射重組IL-36α成熟肽[1 μg/(只·d)，溶于100 μl PBS中]；對照組：在飲用DSS溶液的同時，腹腔注射PBS溶液[100 μl/(只·d)]。按照之前建立的方法[9]，DSS誘導(dǎo)腸炎的每天進(jìn)行模型小鼠的疾病活動指數(shù) (disease activity index，DAI)評分；于DSS腸炎誘導(dǎo)第5日，取結(jié)腸組織1 cm，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 利用GraphPad Prism 7.0軟件完成統(tǒng)計分析，每組均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-36α成熟肽基因工程菌構(gòu)建 選擇菌落PCR為陽性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。經(jīng)測序鑒定正確，即為重組小鼠IL-36α成熟肽基因工程菌。測序結(jié)果如圖1所示。

圖1 pET28a-muture IL-36α質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.1 Recombinant pET28a-muture IL-36α plasmid seq-uencing results

2.2重組小鼠IL-36α成熟肽的誘導(dǎo)表達(dá) 誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體用PBS重懸，將獲得的菌體采用超聲破碎法裂解，離心收集上清液和沉淀分別制樣做SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)鑒定的重組小鼠IL-36α基因工程菌可表達(dá)IL-36α成熟肽，且其主要存在于上清中。通過Image Lab軟件分析可知，誘導(dǎo)溫度為20℃，蛋白表達(dá)量約為16℃蛋白表達(dá)量的1.3倍。因此，優(yōu)選20℃作為后續(xù)實驗的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

2.3重組小鼠IL-36α成熟肽的純化 重組小鼠IL-36α成熟肽基因工程菌在20℃誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，PBS重懸，超聲破碎法裂解菌體，離心收集上清液，使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，收集洗脫下來的樣品做SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)Ni-NAT純化，可獲得純度95%以上的IL-36α成熟肽。

圖2 重組小鼠IL-36α成熟肽的表達(dá)結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of expression of recombinant mouse IL-36α mature peptideNote:M.Protein maker;1.Total bacterial protein without induction;2.Total bacterial protein induced by IPTG at 16℃;3.Protein in supernatant after bacterial disruption at 16℃;4.Protein precipitated after bacterial disruption at 16℃;5.Protein precipitated after bacterial disruption at 20℃;6.Protein in supernatant after bacterial disruption at 20℃;7.Total bacterial protein induced by IPTG at 20℃.

圖3 小鼠IL-36α成熟肽的純化結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of mouse IL-36α mature peptide purificationNote:M.Protein maker;1.Protein in supernatant after bacterial disruption at 20℃;2.The protein eluted by 50 mmol/L imidazole;3.The protein eluted by 100 mmol/L imidazole;4.The protein eluted by 150 mmol/L imidazole;5.The protein eluted by 200 mmol/L imidazole;6.The protein eluted by 300 mmol/L imidazole.

2.4Western blot鑒定重組小鼠IL-36α成熟肽 由于我們構(gòu)建的表達(dá)載體中IL-36α成熟肽與His-Tag融合表達(dá)，所以我們以小鼠抗His-Tag單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot分析來鑒定小鼠IL-36α成熟肽。結(jié)果表明制備的重組小鼠蛋白與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，如圖4所示顯影后在底片上約17 kD處有一明顯條帶，證明了該表達(dá)產(chǎn)物為重組小鼠IL-36α成熟肽。

圖4 Western blot鑒定重組小鼠IL-36α成熟肽Fig.4 Western blot analysis on recombinant mouse IL-36α mature peptideNote:M.Protein maker;1.Negative controls without expression of His-tagged protein;2.Positive protein controls expressing His-tagged protein;3.Recombinant mouse IL-36α mature peptide.

2.5IL-36α成熟肽減輕DSS誘導(dǎo)急性腸炎小鼠腸道炎癥 如圖5所示，與PBS處理組相比，IL-36α成熟肽處理組體重下降減慢，DAI評分明顯降低，腸管縮短減少，組織損傷評分明顯降低。這些指標(biāo)變化說明給予重組IL-36α成熟肽治療減輕了DSS腸炎模型小鼠的腸道炎癥。

圖5 給予IL-36α成熟肽減輕DSS誘導(dǎo)急性腸炎小鼠腸道炎癥Fig.5 IL-36α mature peptide reduced intestinal inflamm-ation in mice with acute colitis induced by DSSNote:A.Weight loss,survival rate and disease activity index;B.Histological score (original magnification,×100);C.Macroscopic changes and colon length;Data indicate of 8 mice of each group obtained from a representative of three independent experiments (n=8 per group).*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

IL-36是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，IL-36 受體(IL-36 receptor，IL-36R)主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞 (dendritic cells，DC)[10,11]。在TCR(T-cell receptor)介導(dǎo)的信號刺激下，IL-36/IL-36R信號能促進(jìn)脾來源的CD4+T細(xì)胞的IL-4、IFN-γ和IL-17A的分泌[12]。IL-36/IL-36R信號可促進(jìn)初始T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-2；IL-36β能夠促使小鼠初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化[10]。IL-36與IL-36R結(jié)合后會招募共受體IL-1受體輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP)，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)MAPK和NF-κB活化等信號級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖與分化及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[13,14]。綜上，IL-36/IL-36R信號主要調(diào)控T細(xì)胞應(yīng)答。

IL-36α在多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用，包括：銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及IBD[15]。最初IL-36α在銀屑病中的作用研究較多。盡管受影響的主要組織存在明顯差異，但銀屑病和IBD之間可能存在一定程度的關(guān)聯(lián)。牛皮癬患者IBD發(fā)病率增加，而IBD患者銀屑病風(fēng)險也增加了[16]。所以，IL-36α在IBD中的作用研究也逐漸興起。Fonseca-Camarillog等[17]發(fā)現(xiàn)IL-36α在IBD患者腸組織中表達(dá)水平明顯升高。此外，在小鼠腸炎模型的結(jié)腸黏膜中，研究人員同樣發(fā)現(xiàn)了IL-36表達(dá)水平升高[18]。Russell 等[19]研究發(fā)現(xiàn)IL-36α的表達(dá)水平在UC患者和小鼠炎癥性結(jié)腸黏膜中特異性升高。與野生型相比，IL-36R-/-小鼠在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中表現(xiàn)出疾病嚴(yán)重程度降低，且固有免疫細(xì)胞在結(jié)腸固有層浸潤減少。該結(jié)果說明IL-36R信號在IBD中發(fā)揮促炎作用。與該研究不同，Scheibe等[7]發(fā)現(xiàn)IL-36R-/-小鼠對DSS的急性結(jié)腸炎具有高度的易感性且傷口愈合能力下降。該結(jié)果說明IL-36R信號可能具有激活黏膜修復(fù)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)給予重組小鼠IL-36α成熟肽能夠減輕小鼠DSS腸炎的癥狀。綜上所述，IL-36/IL-36R信號很有可能在IBD中發(fā)揮雙重作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們成功制備了具有生物學(xué)活性的重組小鼠IL-36α成熟肽，并初步驗證了其在IBD中的作用，為進(jìn)一步研究 IL-36α調(diào)節(jié)腸黏膜免疫的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。