韓美娟 牛 凱 婁運偉 王 輝

(河南省免疫與靶向藥物重點實驗室，新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，新鄉(xiāng) 453003)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)和Crohn′s氏病(Crohn′s disease)，是一組腸道炎癥性疾病，其病因尚不清楚，目前認為炎癥性腸病的發(fā)生主要與遺傳、免疫、腸道菌群和環(huán)境等因素有關[1,2]。盡管大部分研究已經表明，正常生理狀態(tài)下機體內有較多信號通路參與并維持正常腸道上皮細胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)，然而對于腸道組織在外界應激及損傷狀態(tài)下恢復其穩(wěn)定狀態(tài)的機制研究還較為匱乏[3]。

腫瘤壞死因子α誘導的蛋白8(tumor necrosis factor-α induced protein-8,TNFAIP8或TIPE)家族是近些年新發(fā)現的一個蛋白家族，主要由4組成員構成：TNFAIP8(TIPE)、TIPE1(TNFAIP8-like 1，TNFAIP8L1)、IPE2(TNFAIP8-like 2，TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3-like 3， TNFAIP8L3)，家族成員之間具有其獨特的蛋白結構及高度同源的蛋白序列。但TIPE家族成員間也存在著細微的蛋白結構差異，并且在機體組織中的表達也存在差異，提示其家族成員在不同組織中有不同的生物學功能[4]。

TIPE也被稱為SCCS2、GG21或MDC3.13，是TNFAIP8家族最早被發(fā)現的成員。TIPE被首次發(fā)現是在人頭頸部鱗狀細胞癌 (head and neck squam-ous cell carcinoma,HNSCC)患者及來自該患者的轉移性細胞系[1]。TIPE在人的淋巴組織中表達相對較高，在肺、胸腺、脾臟組織表達相對較低[1]。TIPE在腫瘤領域研究的較為廣泛，但目前對TIPE的生理作用包括在腸道組織中的作用知之甚少。本研究旨在探究TIPE在小鼠腸道組織中的表達特點和表達調節(jié)變化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8～10周齡的WT雄性小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠均飼養(yǎng)于無特定病原體級環(huán)境中。

1.1.2主要的試劑與儀器 葡聚糖硫酸酯鈉鹽(dextran sodium sulfate，DSS)(相對分子量為36 000～50 000)購自美國MP Biomedicals公司；逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；β-actin抗體和TIPE抗體(貨號為66009-1和15790-1)、HRP標記的山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗購自Proteintech公司(貨號分別為SA00001-1和SA000 01-2)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymer-ase chain reaction,PCR)儀購自上海賽默飛世爾科技有限公司；Citrobacter rodentium菌為本實驗室保存菌種。

1.2方法

1.2.1取材 頸椎脫臼處死小鼠，取全十二指腸、空腸、回腸、結腸測量其長度。用剪刀將其剖開，PBS漂洗。取3 cm進行研磨后放于-80℃保存， Western blot檢測蛋白表達。再取1.0 cm加入1 ml TRIzol，放于-80℃保存,實時定量PCR檢測mRNA表達。

1.2.2分離結腸上皮細胞 用冷PBS沖洗結腸并切成小塊，將切成小段的結腸在含 EDTA-DTT的HBSS緩沖液中37℃緩慢搖動20 min，用70 μm的濾器過濾后，取上清液，通過離心獲取單細胞。經上皮細胞特異性的抗體EpCam染色后確定，約85%以上的細胞都是EpCam 陽性的結腸上皮細胞。根據需要，分離的結腸上皮細胞，-80℃保存,行Western blot和實時定量PCR檢測。

1.2.3Real-time PCR 細胞中總RNA的抽提使用Invitrogen的TRIzol試劑，并嚴格按照操作手冊操作?；蜣D錄本的擴增使用Applied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System，PCR程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。所用引物序列如表1所示。

1.2.4Western blot 將細胞收集后，提取各組細胞總蛋白，用BCA Kit測定蛋白濃度，用SDS-PAGE膠進行電泳，電泳后進行轉膜，將蛋白樣品轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后，用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，孵育一抗，4℃過夜。用TBST洗膜液洗膜3次后，孵育二抗，室溫孵育1 h，最后用TBST洗滌3次后用發(fā)光液進行曝光。

1.2.5DSS處理小鼠 配制DSS溶液：稱取適量DSS于蒸餾水中，配制成3.0%濃度(w/v)的DSS溶液，配制好的溶液儲存于4℃冰箱，要求現配現用。以3.0%DSS喂養(yǎng)小鼠誘導實驗性結腸炎動物模型，每天觀察小鼠的疾病變化，在不同的時間點處理小鼠，收集樣本。

1.2.6Citrobacter rodentium灌胃 小鼠在Citrob-acter rodentium灌胃之前饑餓過夜，記錄小鼠灌胃前的體重，用無菌灌胃針對小鼠實施灌胃，每只小鼠灌胃約200 μl，其菌量約為2×109的Citrobacter rodentium。灌胃之后小鼠保持正常飲食，每隔2 d記錄一次小鼠體重變化，在不同的時間點處理小鼠，收集樣本。

2 結果

2.1TIPE在結腸組織中高表達 首先檢測TNFAIP8家族成員TNFAIP8(TIPE)、TIPE1、TIPE2和TIPE3在結腸組織中的相對表達，在整個家族成員中，TIPE和TIPE1的表達比TIPE2的表達高，而TIPE3的表達最低(圖1A)，此外實時熒光定量PCR結果顯示，與其他家族成員相比，TIPE在結腸中表達最高(圖1B)。

圖1 TNFAIP8家族基因在小鼠結腸組織中的表達Fig.1 Expression of TNFAIP8 family gene in mouse colon tissueNote:A.The total RNA of distal colon tissue of WT mice was extracted,and the mRNA expression level of TNFAIP8 family members was detected by RT-PCR.β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR for quantifying mRNA expression.These are 3 test results.The graphical data is the relative expression level of the

2.2TIPE在結腸上皮細胞中表達最高 從正常小鼠中分別提取出十二指腸、空腸、回腸和結腸組織中的上皮細胞，與十二指腸、空腸和回腸組織中的上皮細胞相比，Real-time PCR和Western blot結果顯示，TIPE在結腸上皮細胞中表達最高(圖2A、B)。

圖2 TIPE在小鼠腸道組織上皮細胞中的表達Fig.2 Expression of TIPE in mouse intestinal epithel-ial cellsNote:A.Total RNA was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of TIPE mRNA in these epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the protein was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Western blot was used to detect the expression levels of TIPE in tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene(n=5).These are 3 test results.

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in Real-time PCR

2.3TIPE在DSS誘導的結腸炎癥中表達上調 以3.0%DSS喂養(yǎng)WT小鼠誘導實驗性結腸炎，在不同的時間點提取小鼠結腸上皮細胞，RT-PCR和實時熒光定量PCR結果顯示，隨著DSS誘導時間的延長，TIPE在結腸上皮細胞的表達上調(圖3A、B)。

2.4TIPE在Citrobacter rodentium誘導的結腸炎癥中表達上調 用Citrobacter rodentium對WT小鼠灌胃誘導實驗性結腸炎，在不同的時間點提取小鼠結腸上皮細胞，RT-PCR和實時熒光定量PCR結果顯示，隨著誘導時間的延長，TIPE在結腸上皮細胞的表達上調(圖4A、B)。

圖4 TIPE在Citrobacter rodentium感染誘導腸炎過程中在小鼠結腸上皮細胞的表達上調Fig.4 Up-regulation of TIPE expression in mouse colonic epithelial cells during Citrobacter rodentium infection-induced enteritisNote:A.Infecting WT mice with Citrobacter rodentium to induce experimental colitis.The mice were sacrificed at different time points,and total RNA from epithelial cells of mice colon tissue was extracted.Detecting the expression level of TIPE by RT-PCR,β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of TIPE mRNA in these tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the

3 討論

大部分研究發(fā)現TIPE在正常生理過程及病理過程中發(fā)揮著很重要的作用，如調節(jié)糖皮質激素對T細胞凋亡的影響[5]，通過促進巨噬細胞IL-1β和GM-CSF細胞因子的產生來抵抗細菌的感染[6]，通過激活哺乳動物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin,mTOR)激酶保護多巴胺神經元氧化應激誘導的細胞死亡[7]，調節(jié)高糖誘導的腎小球系膜細胞的增殖[8]。但對TIPE在腸道中的生理作用及其具體機制的研究甚少。

近年來隨著我國生活水平、飲食習慣的改變，以及結腸鏡的普遍應用和對疾病的深入認識，我國IBD的就診人數與日俱增，其發(fā)病率在近20年間增長近10倍[9]。在臨床上，IBD的發(fā)病與多種因素有關。IBD患者的臨床表現為腹瀉、黏液血便及腹痛等，病程呈慢性疼痛期與緩解期交替出現，可伴有較多的其他腸道性并發(fā)癥,嚴重影響了患者的生活質量[10]。腸道上皮細胞完整性的維持在保護機體抵抗外界干擾，如藥物、抗原和微生物等的過程中發(fā)揮至關重要的作用，上皮細胞死亡增加和增殖能力降低與DSS誘導的結腸炎的發(fā)生密切相關[11-13]。IBD的發(fā)生主要集中在結腸部位，而本研究證明了TIPE無論在結腸組織還是結腸上皮細胞中均表達較高。并且在構建的兩種試驗性結腸炎模型中TIPE在結腸上皮細胞的表達量隨著DSS處理或Citrobacter rodentium感染時間的延長也隨之增加。這些研究結果提示TIPE可能在DSS 或Citrobacter rodentium感染誘導的小鼠結腸炎中起著重要的調控作用，我們推測在結腸炎過程中，TIPE表達水平上調可能發(fā)揮重要的保護性作用，增強結腸上皮細胞抵抗細胞死亡的能力，從而促進受損的腸道有效快速修復，其具體的作用機制有待更深入的研究。