謝騰飛,張華通,何旭君,賴增哲,李慧釵,趙靜
(廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,廣東 廣州 510520)
鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是蘭科石斛屬類植物,種類繁多,廣泛分布在亞洲、歐洲、澳洲等地區(qū)[1],在我國(guó)主要分布于廣西、廣東、福建、四川、浙江、云南和貴州等西南和華南地區(qū)。野生鐵皮石斛為附生性多年生蘭科植物,主要生長(zhǎng)在溫度濕潤(rùn)、半陰濕的巖石上或者疏林中的樹(shù)干上,對(duì)生態(tài)環(huán)境要求苛刻,生長(zhǎng)溫度為20~26℃,空氣濕度要求需要達(dá)到70%~85%。據(jù)《中國(guó)藥典》版記載,鐵皮石斛歸胃、腎經(jīng);益胃生津,滋陰清熱。鐵皮石斛用于治療不明發(fā)熱、口干舌燥、目暗不明、陰虛火旺、陰傷津虧、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、筋骨無(wú)力等病癥,是傳統(tǒng)的保健中藥材之一[2-3]。
由于野生鐵皮石斛資源較為稀缺,加上人們對(duì)野生資源的過(guò)度采挖,從而導(dǎo)致有些品種已瀕臨滅絕。[4-6]目前,鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)都注重于種植技術(shù)的研發(fā)和規(guī)模的擴(kuò)大,而組織培養(yǎng)工廠化育苗是一種人工栽培非常重要的育苗方式[7]。研究結(jié)果表明,種齡、滅菌方式、外植體選擇、接種密度、繼代周期、培養(yǎng)基配方、移苗方式等諸多關(guān)鍵技術(shù)對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)快繁效果影響很大[8-9]。據(jù)宋爽等[10]報(bào)道,不同的栽培技術(shù)對(duì)鐵皮石斛的質(zhì)量具有明顯的影響,其中以野生資源的鐵皮石斛質(zhì)量最佳。因此,大力開(kāi)展原生態(tài)栽培技術(shù)研究與推廣是提高鐵皮石斛質(zhì)量的一種有效途徑。
本研究基于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)研究,對(duì)工廠化生產(chǎn)育苗工藝流程進(jìn)行優(yōu)化,探索試管苗移植栽培管理技術(shù),以求建立適用于生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛種苗快速繁育體系,并通過(guò)原生態(tài)栽培種植,探索仿野生鐵皮石斛適宜生長(zhǎng)條件,為提高鐵皮石斛仿野生種植效益提供參考。
試驗(yàn)用鐵皮石斛由廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)綜合實(shí)訓(xùn)基地提供的組織培養(yǎng)苗。
1.2.1 鐵皮石斛無(wú)菌播種工廠化生產(chǎn)育苗簡(jiǎn)易工藝流程 外植體主要采用優(yōu)質(zhì)種果,無(wú)菌條件下取種子進(jìn)行培養(yǎng);采用MS 培養(yǎng)基,附加細(xì)胞生長(zhǎng)素NAA0.1~0.6mg/L 和馬鈴薯 20~50g/L 及蘋果泥 20~50g/L。并在無(wú)菌條件下,進(jìn)行鐵皮石斛的無(wú)菌播種及組織培養(yǎng)繼代增殖。無(wú)菌播種發(fā)芽培養(yǎng)及初代培養(yǎng)其培養(yǎng)溫度為25±2℃,光照時(shí)間為10~12h,強(qiáng)度控制在2000~3 000lx。經(jīng)90 d 左右培養(yǎng)即可萌發(fā)出大量的小苗。以后均采用同一培養(yǎng)基,每90 d 轉(zhuǎn)接1 次,連續(xù)轉(zhuǎn)接2 次,小苗嫩莖長(zhǎng)到3 cm 左右,根系完整即可進(jìn)行煉苗移栽。
1.2.2 試管生根苗處理 經(jīng)培養(yǎng)室壯苗生根培養(yǎng)約30 d 的小苗置于塑料大棚進(jìn)行煉苗,經(jīng)生根煉苗60 d 后,選擇苗高3~5cm、生長(zhǎng)正常、長(zhǎng)勢(shì)較好的試管生根苗。用鑷子輕輕地夾出煉好的試管生根苗,置于裝有干凈自來(lái)水的塑料盆里,清洗2 遍,以洗凈培養(yǎng)基。并用0.01%的高錳酸鉀溶液浸泡5min,自來(lái)水清洗,甲基托布津水溶液浸泡2 min。
1.2.3 試管生根苗種植及栽培管理 試管生根苗在清洗消毒后,栽植于遮陽(yáng)網(wǎng)墊底,長(zhǎng) 寬 高為50 40 7cm,排水良好的塑料篩中。種植時(shí),用手輕捏,使試管生根苗的根部與基質(zhì)充分接觸。種植后,放在有遮陰的標(biāo)準(zhǔn)塑料大棚進(jìn)行栽培管理。最初2 d 內(nèi)不用澆水,第3 天開(kāi)始淋第1 次促根殺菌營(yíng)養(yǎng)液(翠筠B1 營(yíng)養(yǎng)劑+多菌靈+磷酸二氫鉀溶液),以后每10 d噴施該溶液1 次并保持種植基質(zhì)經(jīng)常處于濕潤(rùn)狀態(tài)。與此同時(shí),需要防治病蟲(chóng)害。
1.2.4 不同方法處理鐵皮石斛試管苗移植對(duì)比試驗(yàn)本試驗(yàn)對(duì)試管苗消毒后進(jìn)行2 個(gè)對(duì)比處理,分別為消毒后晾苗2 d 后種植(水珠干透、根系變白)和洗苗消毒后直接種植,并記錄移植60 d 后的生長(zhǎng)情況。
1.2.5 移栽培養(yǎng)基質(zhì)篩選試驗(yàn) 單一移栽基質(zhì)篩選:本試驗(yàn)采用松樹(shù)皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5個(gè)處理,對(duì)移植60 d 后試管生根苗的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察分析。
混合移栽基質(zhì)篩選:本試驗(yàn)移栽基質(zhì)設(shè)計(jì)為J1(木屑∶松樹(shù)皮=3∶2)、J2(木屑∶陶粒=3∶2)、J3(苔蘚∶小石粒=3∶2)、J4(泥炭土∶陶粒 3∶2)、J5(紅火山巖∶小石粒3∶2)、J6(松樹(shù)皮∶紅火山巖3∶2)6 個(gè)處理,記錄移植60 d 后的生長(zhǎng)情況。
1.2.6 不同季節(jié)栽培對(duì)比試驗(yàn) 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為春(3~5月)、夏(6~8 月)、秋(9~11 月)、冬(12~2 月)4 個(gè)季節(jié)對(duì)馴化苗移栽成活及生長(zhǎng)情況的影響。栽培基質(zhì)為J6(松樹(shù)皮∶紅火山巖3∶2),采用3 寸盆種植。移栽后,記錄栽培苗的生長(zhǎng)情況。
1.2.7 鐵皮石斛的原生態(tài)栽培方式對(duì)比試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用枯立木附生種植、吊籃種植和活樹(shù)體附生種植3個(gè)對(duì)比處理??萘⒛靖缴N植選擇直徑為15 cm 左右的原木,置于光線充足、遮陰樹(shù)下光照通透的位置,在原木皮層按株距20 cm 的密度種植,用少量苔蘚包裹后貼于樹(shù)皮上,再用麻繩綁緊固定,根系要求自然伸展;吊籃掛在樹(shù)枝上,保持吊籃處透光較足,且避免強(qiáng)光直接照射;活樹(shù)體附生種植選擇附生樹(shù)中光線充足、通透的枝干部位,按株距20 cm的密度種植,用少量苔蘚包裹后貼于樹(shù)皮上,再用麻繩綁緊固定,根系要求自然伸展;種苗規(guī)格為鐵皮石斛組織培養(yǎng)馴化苗達(dá)到主莖長(zhǎng)6 cm 以上,輔莖長(zhǎng)4 cm 以上;主莖粗0.4 cm 以上,輔莖粗0.1 cm以上。記錄附生及種植后的生長(zhǎng)情況。
本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)種子消毒,嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒o(wú)菌操作及良好的誘導(dǎo)、壯苗培養(yǎng)基等技術(shù)的研究,探索出了鐵皮石斛無(wú)菌播種工廠化生產(chǎn)育苗簡(jiǎn)易工藝流程:鐵皮石斛莢果外植體消毒→種子無(wú)菌發(fā)芽培養(yǎng)→無(wú)菌小苗轉(zhuǎn)接增殖培養(yǎng)→塑料大棚生根煉苗→試管生根苗種植。整個(gè)過(guò)程只采用一種培養(yǎng)基為MS+NAA(0.1~0.6 mg/L)+馬鈴薯泥(20~50g/L)+蘋果泥(20~50g/L)+蔗糖(30g/L)。利用這一技術(shù)培育出大量的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗,以滿足后續(xù)試驗(yàn)及生產(chǎn)的需求(圖1)。
圖1 鐵皮石斛工廠化組培苗Fig.1 Tissue culture seedlings of D.otticinale
對(duì)比試管苗消毒后晾苗2 d 后種植(使附苗上無(wú)水珠、根系變白)和洗苗消毒后直接種植〔移栽基質(zhì)均采用J1(木屑∶松樹(shù)皮=3∶2)〕,移植于標(biāo)準(zhǔn)塑料大棚進(jìn)行栽培管理,期間對(duì)移植后試管苗根、苗的生長(zhǎng)狀況及移植成活率進(jìn)行觀察記錄,并在60 d 后統(tǒng)計(jì)其移栽成活率。從表1 中可得出,鐵皮石斛試管苗經(jīng)晾苗處理后,平均移栽成活率達(dá)到95.0%,明顯優(yōu)于試管苗直接種植的72%成活率;根和苗生長(zhǎng)比較結(jié)果,試管苗經(jīng)晾苗處理后8 d 左右可以長(zhǎng)出新根,而直接種植的試管苗要在14 d 后才能長(zhǎng)新根,新根長(zhǎng)度較短,較為嚴(yán)重的是,有些根出現(xiàn)腐爛情況;經(jīng)晾苗處理后的試管苗在大概10 d能長(zhǎng)出新葉,而直接種植的試管苗長(zhǎng)勢(shì)較差,并部分苗出現(xiàn)腐爛。因此,可以得出晾苗處理有利于鐵皮石斛試管苗移植生長(zhǎng)。
為了解單一移栽基質(zhì)在鐵皮石斛試管苗移植培養(yǎng)中的效果,通過(guò)采用松樹(shù)皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5 種基質(zhì)進(jìn)行栽培,期間對(duì)移栽后試管苗的生長(zhǎng)狀況及移植成活率進(jìn)行觀察記錄,并統(tǒng)計(jì)其移栽成活率,結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示,單一基質(zhì)的培養(yǎng)中,松樹(shù)皮基質(zhì)培養(yǎng)的效果最好,成活率達(dá)到89.5%,而在泥炭土中,培養(yǎng)成活率只有32.1%;試管苗在松樹(shù)皮、木屑中生根較為理想,在苔蘚、泥炭土及紅火山巖基質(zhì)中,根長(zhǎng)勢(shì)很差,根細(xì)且短,還出現(xiàn)部分腐爛現(xiàn)象。
表1 鐵皮石斛試管苗移植中不同處理方法的對(duì)比試驗(yàn)Table 1 Different treatment methods in D.otticinaletube seedling transplantation
在采用不同混合基質(zhì)培養(yǎng)鐵皮石斛試管苗移栽的結(jié)果顯示,在J1、J2 和J6 這三種混合基質(zhì)中,成活率達(dá)到90%以上,在J4 和J5 中的成活率較低,分別為68.0%、76.0%。在成活率較高的三種混合基質(zhì)中,我們也發(fā)現(xiàn)在一個(gè)星期內(nèi)可以長(zhǎng)出新根,根系發(fā)達(dá),根長(zhǎng)且較粗壯。而J4 和J5 基質(zhì)根長(zhǎng)勢(shì)差,很細(xì)弱。苗的新芽萌發(fā)及葉片增加的速度在J1、J2 和J6 混合基質(zhì)中明顯優(yōu)于成活率較低的混合基質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,以J6 為基質(zhì)栽培效果最好,而且也符合經(jīng)濟(jì)原則(見(jiàn)表3)。
表2 鐵皮石斛試管苗移植中不同單一移栽基質(zhì)中的種植對(duì)比試驗(yàn)Table 2 Different single transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation
表3 鐵皮石斛試管苗移植中不同混合移栽基質(zhì)中的種植對(duì)比試驗(yàn)Table 3 Different mixed transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation
為了解鐵皮石斛試管苗在不同季節(jié)移植栽培的效果,我們進(jìn)行了春夏秋冬的移植對(duì)比,結(jié)果(見(jiàn)表4)顯示,春季和秋季的栽培效果最好,成活率高達(dá)92.0%和96.0%,而夏季和冬季栽培效果不理想。雖然秋季成活率較高,但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其根系發(fā)育速度明顯落后于春季(長(zhǎng)根時(shí)間分別為20 d 和58 d)。在冬季,鐵皮石斛移栽成活率僅為26.5%,未見(jiàn)新根有明顯變化。苗的生長(zhǎng)情況也存在相同趨勢(shì),春天移栽的試管苗生長(zhǎng)快。其次為秋季、夏季。而冬季苗未見(jiàn)長(zhǎng)高,只是莖稍有長(zhǎng)粗。試驗(yàn)結(jié)果表明春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳選擇,秋冬季時(shí)生長(zhǎng)緩慢,尤其是冬季,不適宜栽培種植鐵皮石斛。
由于鐵皮石斛主要在野外附生性生長(zhǎng),為保證鐵皮石斛的價(jià)值,需要采用原生態(tài)的栽培方式(圖2)。本試驗(yàn)中,我們采用了枯立木附生種植、吊籃種植和活樹(shù)體附生種植這三種原生態(tài)的栽培方式。結(jié)果顯示吊籃種植的成活率最高,高達(dá)95.0%,其次為活樹(shù)體附生種植(89.5%),枯立木附生種植(85.5%)。而且吊籃種植的根系生長(zhǎng)也是最快的,但活樹(shù)體附生種植的根系最為發(fā)達(dá),可以和活體樹(shù)皮相互緊密纏繞。苗的生長(zhǎng)速度差別不大。本試驗(yàn)表明,在原生態(tài)栽培過(guò)程中,吊籃種植的生長(zhǎng)情況最好,但也發(fā)現(xiàn)活樹(shù)體附生種植鐵皮石斛的效果也不錯(cuò)(表5)。
圖2 鐵皮石斛的原生態(tài)栽培Fig.2 Ecological cultivation of D.otticinale
鐵皮石斛為多年生附生蘭的草本植物,在野外狀態(tài)下,鐵皮石斛種子繁殖力低,在發(fā)芽率、萌發(fā)、生長(zhǎng),及開(kāi)花的鐵皮石斛結(jié)實(shí)率也很低[11],這些原因?qū)е缕溆行陨车淖匀环敝陈实?。而需求量的快速增加,加急了鐵皮石斛的稀缺。因此,隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,利用組織培養(yǎng)的種苗,并采用人工大規(guī)模種植的鐵皮石斛是市場(chǎng)上產(chǎn)品的主要來(lái)源[12]。本實(shí)訓(xùn)中心主要以組織培養(yǎng)技術(shù)研究為主,培養(yǎng)了菊花、金叉石斛和迷迭香等多種經(jīng)濟(jì)植物[13-14],有一套非常完善的組織培養(yǎng)及工廠化育苗的技術(shù)。通過(guò)不斷摸索,已經(jīng)建立了一套成熟的鐵皮石斛組培方法,并能進(jìn)行工廠化生產(chǎn)育苗,該技術(shù)成活率高、可產(chǎn)出高質(zhì)量苗。在此期間,我們發(fā)現(xiàn)試管生根苗移栽過(guò)程處理是鐵皮石斛組培成功運(yùn)用于生產(chǎn)的重要步驟,因此對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)的研究。與此同時(shí),本研究還嘗試了不同的原生態(tài)種植方法,以求獲得高質(zhì)量的鐵皮石斛鮮條,滿足市場(chǎng)需求。
獲得能夠移栽到田間的鐵皮石斛苗是繁育技術(shù)的核心問(wèn)題,因此需要保證移栽的成活率。楊大贊報(bào)道認(rèn)為在試管苗清洗時(shí),根莖都很脆弱,易受到真菌感染,最好進(jìn)行根系的脫水處理[15]。本試驗(yàn)結(jié)果證明了這個(gè)觀點(diǎn),通過(guò)比較晾苗2 d后種植和直接種植處理,晾苗后成活率明顯較高;根的生長(zhǎng)良好,苗長(zhǎng)葉及發(fā)育也快,而直接種植的試管苗的根會(huì)出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象,這應(yīng)該是跟真菌感染有關(guān),而芽的長(zhǎng)勢(shì)也比較差。本研究表明采用洗苗消毒后晾苗2 d的處理方法,有助于鐵皮石斛試管苗的移植生長(zhǎng)。
培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)植物的影響是顯而易見(jiàn)的,在選擇植物培養(yǎng)基質(zhì)時(shí),需要結(jié)合實(shí)際生長(zhǎng)情況,從而保證成活率和生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。一般認(rèn)為,不同種類的微生物會(huì)附生在野生的鐵皮石斛根系中,從而分解土壤中的有機(jī)物。因此,人工基質(zhì)很難達(dá)到自然的效果。因此,會(huì)選擇碎石子、泥炭土、火山巖和木屑等作為培養(yǎng)基質(zhì)。有研究報(bào)道木屑、泥炭土的保水能力較好質(zhì),椰子絲、松樹(shù)皮可以增加基質(zhì)的透氣性,不同基質(zhì)的混合使用不僅可以滿足基質(zhì)保水需求,還可以改善基質(zhì)的透氣[16]。本試驗(yàn)顯示單一基質(zhì)最高的成活率僅為 89.5%(松樹(shù)皮),大部分單一基質(zhì)中的成活率都較低。松樹(shù)皮+紅火山巖(3∶2)為混合基質(zhì)栽培時(shí),成活率最高,根的長(zhǎng)勢(shì)也是最好。在單一基質(zhì)如泥炭土、紅火山巖中,鐵皮石斛根系還發(fā)生了部分腐爛現(xiàn)象。由此,本研究得出的試管生根苗最佳移栽基質(zhì)為木屑+松樹(shù)皮,既有較好的保水能力,還能透氣。
由于光照、溫度和水分對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)有重要作用[17-18],因此,不同栽植季節(jié)對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響也是顯而易見(jiàn)的。通過(guò)對(duì)福建地區(qū)鐵皮石斛種植的季節(jié)影響進(jìn)行探索,結(jié)果顯示,鐵皮石斛在春、秋、夏季其單叢鮮重、萌芽數(shù)生長(zhǎng)有極顯著差異,以春季栽植為優(yōu),秋季則次之,秋季栽植則應(yīng)做好抗寒防凍工作[19]。在廣東,我們也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢(shì)。在夏季,可能由于溫度太高,鐵皮石斛的成活率和長(zhǎng)勢(shì)都不好。而冬季是鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)積累的時(shí)期,加之溫度過(guò)低,其栽培成活率非常低。本研究得出春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳季節(jié)。
環(huán)境因子會(huì)使植物表型及生理生態(tài)特性產(chǎn)生不同的變化[20]。鐵皮石斛的組培苗、大棚栽培植株及野生植株?duì)I養(yǎng)成分比較發(fā)現(xiàn),野生栽培鐵皮石斛的多糖含量高于人工栽培的鐵皮石斛,還有人工栽培鐵皮石斛所含微量元素低于野生栽培[21]。而且,采用樹(shù)皮等仿生基質(zhì)有助于提高鐵皮石斛的蛋白質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。因此,原生態(tài)種植是鐵皮石斛栽培的重要方式。目前報(bào)道的原生態(tài)種植主要采用活樹(shù)體附生種植。崔之益等[22]分別采用降香黃檀、馬占相思、龍眼、楊桃等進(jìn)行鐵皮石斛附生種植,結(jié)果顯示,其生長(zhǎng)的莖粗細(xì)、長(zhǎng)短及生物產(chǎn)量與其植株高度呈顯著性相關(guān)??萘⒛靖缴N植和吊籃種植的研究較少,主要適用于樹(shù)木不多的林地種植。本研究發(fā)現(xiàn)吊籃種植中鐵皮石斛的成活率及根苗長(zhǎng)勢(shì)最好,這可能與而其遠(yuǎn)離地面種植,生長(zhǎng)空間大,光環(huán)境和通風(fēng)環(huán)境均優(yōu)于其它原生態(tài)栽培方式,能有效促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,除活樹(shù)體附生種植外,吊籃種植也是一種比較好的種植栽培模式選擇??萘⒛靖缴N植雖比活立木種植、吊籃種植表現(xiàn)稍差,但采用活立木種植和吊籃種植結(jié)合進(jìn)行,可以充分利用空間,大大提高了單位面積鐵皮石斛的鮮條產(chǎn)量。
試管苗的移栽是鐵皮石斛組織培養(yǎng)工廠化育苗中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于試管苗始終處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的無(wú)菌環(huán)境下,對(duì)外界自然環(huán)境的適應(yīng)性其是否移植成功決定影響試管苗移栽成敗因素包括馴化苗的選擇、栽培基質(zhì)的選擇和溫度濕度光照等。本研究以組培生根的鐵皮石斛試管苗為材料,通過(guò)試驗(yàn),證明了鐵皮石斛試管苗移植過(guò)程中,通過(guò)晾曬2 d 處理有助于提高移植是成活率;最優(yōu)的基質(zhì)為松樹(shù)皮+紅火山巖(3∶2)混合,是生產(chǎn)容易推廣的材料,具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益。栽培試驗(yàn)結(jié)果顯示,種植栽培的季節(jié)應(yīng)當(dāng)以春季為優(yōu),氣溫適宜,空氣濕度大。秋季應(yīng)做好抗寒防凍工作。夏季和冬季由于氣候,不利于鐵皮石斛生長(zhǎng)。原生態(tài)栽培對(duì)比證明吊籃種植是除活樹(shù)體附生種植外的理想方式。這為尋找鐵皮石斛組培工廠化育苗尋找更為高效的移栽方法,及大面積推廣原生態(tài)鐵皮石斛栽培提供技術(shù)參考。