趙向遠，許保增

（中國農業(yè)科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林 長春 130112）

在哺乳動物的早期胚胎發(fā)育中，受精后的胚胎基因組激活（Embryo genome activation,EGA）是一個十分復雜的過程，需要細胞核和細胞質中一系列的分子調控機制，來確保兩個親本基因組可以在轉錄發(fā)生前進行重新編程和重組[1]。大量數(shù)據(jù)顯示，某些基因在核重編程過程中如轉錄不當會對胚胎發(fā)育產生長期的不利影響。因此，準確控制EGA 的發(fā)生時間對胚胎發(fā)育有著至關重要的作用。在大多數(shù)哺乳動物中，基因組的激活是逐步進行的，這一發(fā)現(xiàn)對考慮調控這一過程的相關機制具有重要意義[2]。如小鼠的EGA可分為三個轉變時期：①在1 細胞晚期，合子的基因組僅具有很微弱的轉錄活性；②在2 細胞早期（G1/S期）合成少量的蛋白質包括70 kDa 熱應激蛋白（Heatshock protein）、TRCs（Transcription-requiring complexes）、U2afbp-rs 剪切因子（Splicing factor）及翻譯起始因子—eIF-4C；③第二輪DNA 復制后的2 細胞晚期，開始合子基因激活的主要期，轉錄和翻譯活性增加，導致蛋白質合成的形式發(fā)生巨大變化[1]。在其他哺乳動物中，早期胚胎基因激活的時間稍晚一些，發(fā)育過程中需要轉錄的時間也稍遲一些。通常，基因激活的主要期在第2～3 次卵裂后開始，如兔子、牛、恒河獼猴和人類的基因組激活事件主要發(fā)生在4～8 細胞階段[2]。具體來說，有些基因在主要的基因組激活發(fā)生之前就已經被轉錄了，其中大多數(shù)管家基因被激活。而染色質蛋白含量的變化，特別是組蛋白和染色質結構的變化，能夠調節(jié)基因組進行轉錄，并提供轉錄的特異性，基因增強子的轉錄也隨著染色質結構的改變而激活[1]。在胚胎基因組轉錄激活的早期和后期階段，轉錄因子的活性和蛋白質的合成也都是必不可少的，染色質結構的改變和轉錄因子活性能夠為DNA 復制和裂解等過程提供一定的協(xié)調作用，這都是細胞周期依賴機制調控的結果[3]。在臨床上，許多體外成熟的卵母細胞在受精后的不同階段會出現(xiàn)發(fā)育停滯的現(xiàn)象，原因可能是基因變異，也可能是培養(yǎng)條件不合適[4]。因此，了解胚胎植入前胚胎發(fā)育能力的環(huán)境因素和分子調控機制，對于提高輔助生殖技術的成功率具有重要意義。

1 組蛋白修飾對哺乳動物早期胚胎發(fā)育的調控

組蛋白修飾在調控哺乳動物胚胎發(fā)育過程中對發(fā)育基因的表達具有十分重要的作用。在早期胚胎的基因組激活過程中，決定哪些基因可以轉錄以及何時轉錄的關鍵因素之一就是控制染色質結構的改變時間[5]。決定染色質結構的一個主要因素是與DNA 相關的組蛋白類型，核心組蛋白包括組蛋白H2A、H2B、H3 和H4，它們將DNA 組裝成核小體[6]。其他的連接組蛋白，包括組蛋白H1 的多變體和其它特定的發(fā)育形式，與核小體之間的DNA 相連，并負責染色質的凝聚。而在發(fā)育過程中，不同的連接組蛋白與卵母細胞、早期胚胎和后期體細胞的染色質有關。在4 細胞階段，第1個被鑒定的細胞間分子差異是組蛋白H3 精氨酸甲基化水平的差異，特別是R26 和17[7]，同時，高H3 甲基化水平與Nanog 和Sox2 表達的增加有關。在8 細胞階段，一些細胞會表達更高水平的與TE 有關的特異性轉錄因子Cdx2[8]。連接組蛋白的這些差異影響了染色質結構，因為不同的連接組蛋白在它們與DNA的整體堿度和緊密度上有所不同，核心組蛋白與DNA的結合可以通過磷酸化和乙?；瘉碚{控。其中，組蛋白尾部賴氨酸殘基的乙?；瘻p少了DNA 與核心組蛋白的接觸，并通過其他DNA 結合蛋白進入DNA[9]。在小鼠體內，一種由早期卵母細胞編碼的特異性組蛋白H1，從4 細胞發(fā)育到8 細胞階段的表達下降。有研究報道，組蛋白H1 首次出現(xiàn)在4 細胞階段[3]；也有研究稱組蛋白H1 在胚胎的2 細胞期有表達，甚至在1 細胞期就開始表達。在后者的研究中，沒有觀察到與MII中期紡錘體相關的組蛋白H1 的表達，而是與兩個原核有關[10]。在小鼠胚胎的1 細胞階段，組蛋白H1 的合成是不依賴于轉錄的，且明顯受卵母細胞編碼mRNA 的驅動。組蛋白H1 在2 細胞階段合成下降，然后在4 細胞階段恢復，這與從卵母細胞編碼的組蛋白H1轉錄本表達到胚胎轉錄本表達的轉變相一致[11]。同樣地，牛體細胞中組蛋白H1 直到8 細胞階段才在早期胚胎中檢測到。因此，早期胚胎中組蛋白H1 亞型表達的轉變可能反映的是卵母細胞的需求，而不是表達早期胚胎的特定功能。

組蛋白表達的其他變化發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段。組蛋白 H2A 和 H3 的合成在1 細胞和2 細胞階段上調，但部分受到-鵝膏菌素的抑制[12]。在這些階段中，組蛋白H4 的合成對于基因轉錄而言是獨立的。因此，盡管在1 細胞和2 細胞階段，母體的轉錄本似乎完全負責H1 和H4 的表達，但胚胎基因組中也可能出現(xiàn)一些H2A 和H3 的表達，這可能有助于這些階段中與基因組激活相關的染色質變化[13]。在體細胞中，組蛋白的合成是通過瞬時轉錄、翻譯和隨后的mRNA降解來調控和偶聯(lián)到S 期[9]。相比之下，在1 細胞階段，胚胎中組蛋白的合成除了胚胎組蛋白H2A 和 H3 基因的部分表達外，在很大程度上與S期不偶聯(lián)，受母體mRNA募集水平的調控[10]，這種對母體編碼mRNA的依賴為支持組蛋白在轉錄沉默早期轉變提供了必要的機制。

2 細胞周期協(xié)調細胞質和核事件調控哺乳動物的早期胚胎發(fā)育

在利用mRNA 改變染色質結構和轉錄因子的階段特異性合成來控制整個基因組激活的過程中，可能需要涉及染色質重組和組蛋白乙?；暮耸录团c蛋白質合成和翻譯后相關的細胞質事件之間相互協(xié)調。但有研究認為這種協(xié)調并非基因組激活所必需的，因為基因組激活的時間僅由細胞質或核事件決定，而不是由兩者共同決定[14]。但在這種情況下胚胎可能存在基因組激活不完全或不正確的風險。例如，如果基因組活化僅由核事件控制，缺乏細胞質對必需轉錄因子的控制可能導致早產[15]，然后通過正常蛋白質更新而過早降解，從而導致了這些轉錄因子的表達下降。相反，如果在核重編程之前激活轉錄因子并且建立精確的與基因調節(jié)相適應的轉錄抑制狀態(tài)，那么嚴格的細胞質調控機制可能會在基因激活中發(fā)生錯誤[16]。

細胞周期是一個協(xié)調細胞質和細胞核事件的有效手段。例如，在S 期可以調節(jié)染色質結構的變化，同時細胞周期依賴性激酶可以調節(jié)關鍵轉錄因子和mRNA隱蔽、聚腺苷酸化或翻譯因子的活性，從而影響母體mRNA 的翻譯[3]。同時，細胞周期的進展確實會影響基因組的激活。例如，用DNA 聚合酶抑制劑阿非迪霉素（Aphidicolin）處理小鼠胚胎可降低1 細胞期的基因轉錄，同時也抑制了eIF-1A 基因的表達[18]。這些結果表明，第一輪的DNA復制可能促進基因組的激活，第二輪DNA 復制也對基因轉錄有一定的影響，許多基因在小鼠胚胎的2 細胞階段表現(xiàn)出短暫的轉錄爆發(fā)，如Aphidicolin 能夠在S 期阻止這些基因誘導的轉錄下調，并使在2 細胞階段整體基因轉錄水平升高[18-19]。因此，第一輪DNA 復制是基因轉錄所必需的，也是創(chuàng)造轉錄抑制狀態(tài)的第一步，第二輪DNA 復制完成了向轉錄抑制狀態(tài)的過渡。

前兩輪DNA 復制的抑制作用可能包括結合去乙?；M蛋白、改變DNA 與核基質的偶聯(lián)等其他特定變化。雖然這些變化在本質上是抑制轉錄的，但實質上它們是基因組激活的重要組成部分，因為它們可能提供正確調節(jié)轉錄基因的能力[20-21]。由于染色質結構的變化，可能僅僅是那些必需的轉錄因子有啟動子的基因表達，雖然具有強啟動子或增強子的基因會優(yōu)先表達，但在這一過程中，許多其他基因也可能表達，尤其是在基礎轉錄水平[22]。但轉錄的抑制狀態(tài)會減少這些不必要基因的表達，而強啟動子或增強子調控的基因將會持續(xù)表達，這對接下來的基因激活至關重要。

3 轉錄因子對基因組激活的影響

雖然早期胚胎染色質結構的變化在基因組激活中起到關鍵的作用，但單憑這些并改變并不能激活胚胎基因組的轉錄。在核轉移之后，轉錄能力強的細胞核進行轉錄的能力取決于受體細胞質的發(fā)育階段[23]。細胞質中的變化，尤其是轉錄因子的可用性、含量或是活性的變化在基因組激活中發(fā)揮同樣重要的作用。例如，Hox是動物早期胚胎發(fā)育過程中的重要調控因子，在許多動物物種中，Hox 基因簇以共線性的方式控制著轉錄調控過程。在胚胎發(fā)育的第8.5 天，Hox 通過PRC1（Polycomb repressive complex 1）和 PRC2（Polycomb repressive complex 2）中的一組組蛋白修飾酶，結合甲基化組蛋白尾部的蛋白，在H3K4me3 處催化組蛋白H3 甲基化進行轉錄激活，控制脊椎動物身體軸的發(fā)育[24-25]。在果蠅中，轉錄因子Zelda 特異性地與合子基因最早的啟動子結合，并啟動它們進行激活，但目前還不清楚其他動物是否也有類似的現(xiàn)象[26]。研究表明，與哺乳動物多能性轉錄因子Oct4 同源的斑馬魚Pou5f1 在合子轉錄開始前就占據(jù)了SOX-POU的結合位點，并激活了最早的合子基因[27]。適當?shù)腞NA 聚合酶活性對轉錄激活十分重要。對大多數(shù)基因而言，RNA 聚合酶II 的羧基末端結構域（CTD）的過度磷酸化對轉錄激活是必需的[28]。在小鼠、家兔和非洲爪蟾中，CTD 在卵母細胞成熟過程中過度磷酸化，受精后不久磷酸化程度降低，然后在向2 細胞階段過渡時磷酸化程度又增加[29]，這一磷酸化的改變可能與核定位的突然增加有關。因此，RNA 聚合酶II 磷酸化狀態(tài)的改變可能是基因組激活的關鍵。

其他轉錄因子如Sp1、CBP、TBP和其他更特殊的轉錄因子，包括轉錄抑制蛋白在磷酸化狀態(tài)發(fā)生了變化[30]。例如，在許多系統(tǒng)中，Sp1 的DNA 轉錄活性在卵母細胞成熟時因磷酸化而降低。但是在1 細胞階段的G1 和G2 期觀察到Sp1 的磷酸化水平增加，并在后期被激活[31]。有關轉錄因子的其他變化可能是啟動子發(fā)生顯著變化的基礎，小鼠的eIF-1A基因在2 細胞階段被誘導激活，但隨后表達有所下降。在成熟的卵母細胞中，約70%的轉錄產物來自于近端含有TATA的啟動子[32]。在基因組激活后，啟動子發(fā)生了一個轉變，即不含TATA 的啟動子使用效率更高。在早期小鼠胚胎或胚胎干細胞中，啟動子活性或增強子介導的轉錄激活不需要TATA 盒，但在卵母細胞中則需要含有TATA 的啟動子有效表達[31,33]。啟動子的這種變化可能反映了轉錄因子含量的差異，這使得卵母細胞有其特有的轉錄序列，并伴隨著轉錄組激活相關基因的表達。

4 結論與展望

胚胎基因組激活作為哺乳動物胚胎著床前發(fā)育的重要階段，主要事件是來自胚胎基因組表達的轉錄本取代了指導早期發(fā)育的母體轉錄本。雖然現(xiàn)在對早期胚胎發(fā)育的調控機制已經有了很多了解，但仍有很多問題目前尚未解決。蛋白質的合成和母體mRNA 的轉錄抑制雖然在基因組激活中發(fā)揮著重要作用，但我們對募集到的母體轉錄本序列及其編碼蛋白所發(fā)揮的功能知之甚少，關于細胞周期的通路是如何調控這些mRNA 翻譯的機制也不甚了解。近年來，隨著生殖技術的發(fā)展和研究的進步，這些問題將很快得到解決。我們可以利用單細胞 RNA-seq 技術用于轉錄組定量分析，獲得細胞分裂各階段的重要標記，并應用相關的技術手段對早期胚胎發(fā)育過程中關鍵階段的候選基因進行進一步的研究，以前所未有的廣度和深度探討這一過程中重要的分子事件，這必將為哺乳動物胚胎發(fā)育及生存和繁衍的調控提供新的理論依據(jù)和技術支持。