唐炳強(qiáng) 耿紅全 林厚維 徐卯升 徐國鋒 方曉亮 賀 雷

隱睪是男性最常見的先天性泌尿生殖系統(tǒng)畸形之一，足月兒患病率為2%～4%[1]，早產(chǎn)兒患病率高達(dá)30%[2]，1歲時患病率為1%～2%。隱睪可單獨(dú)發(fā)病，也可合并其他先天性畸形(如性別發(fā)育異常)[3]。目前學(xué)界普遍認(rèn)為隱睪是基因、內(nèi)分泌和環(huán)境相互作用并影響的結(jié)果，而基因與本病發(fā)生的因果關(guān)聯(lián)仍不明晰[4]。由于胚胎性別發(fā)育的正常過程和機(jī)制尚未完全明確，且性別異常的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，因此對性發(fā)育異常進(jìn)行病因診斷仍較為困難。

高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展成熟為我們提供了新的病因?qū)W研究方法，也促進(jìn)了全外顯子測序技術(shù)的發(fā)展。近年來，全外顯子測序作為一種快速而經(jīng)濟(jì)的技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷[5]。睪丸下降過程及性別分化過程涉及的基因廣泛，采用外顯子測序技術(shù)可能有助于發(fā)現(xiàn)致病基因或新發(fā)的突變位點，為揭示隱睪和性別分化的深層次發(fā)病機(jī)制提供線索和依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

研究對象均就診于上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院，共19例。其中單純腹股溝隱睪4例，隱睪合并尿道下裂6例，合并小陰莖6例，兩性畸形2例，合并先心病1例。

二、臨床資料收集

詳細(xì)收集所有患兒的病史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果，具體包括年齡、外生殖器表型(陰莖發(fā)育情況、大小、尿道開口位置、有無陰莖彎曲、睪丸的位置、大小、是否存在陰囊分裂、陰莖陰囊轉(zhuǎn)位)、社會性別、家族史、染色體核型、激素水平(包括睪酮T、二氫睪酮DHT、卵泡刺激素FSH、黃體生成素LH、雌二醇E2、17α-羥孕酮、HCG激發(fā)試驗)、影像學(xué)檢查結(jié)果、手術(shù)史、病理結(jié)果。

三、基因測序方法

1. 基因組DNA的提取 對19例患兒外周血樣本進(jìn)行基因組DNA抽提(Lab-Aid核酸提取試劑盒)，應(yīng)用Nanodrop 2000/2000c分光光度儀檢測DNA濃度及純度(OD260/OD280比值)；OD值在1.8～2.0之間、含量在1.5 μg以上的基因組DNA樣品儲存于-80℃冰箱中備用。

2. 建庫及測序 全基因外顯子測序3例，目標(biāo)基因外顯子測序16例。基因組DNA建庫和目標(biāo)區(qū)域捕獲分別采用Agilent SureSelect Human All ExonV5及Inherited disease panel試劑盒。外顯子區(qū)域DNA經(jīng)高效富集、捕獲后采用PCR線性擴(kuò)增，并進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格的樣品外顯子文庫通過HiSeq2500測序平臺(Illumina，USA)進(jìn)行高通量、高深度測序。統(tǒng)計各樣品Illumina原始下機(jī)測序序列(Reads)的測序生成數(shù)據(jù)量、平均測序深度、覆蓋度等數(shù)據(jù)。

3. 數(shù)據(jù)處理 使用BWA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)序列比對，對照參考序列來源于千人基因組(http：//www.1000genomes.org)和美國國家生物技術(shù)信息中心第37版人類基因組序列(GRCh37)，比對后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行GATK基因型分型分析，以ANNOVAR 11注釋變異，以Exome Depth檢測拷貝數(shù)變異。過濾掉不影響基因功能的同義突變位點以及公共遺傳突變數(shù)據(jù)庫(dbSNP137數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫)中正常人攜帶的常見突變位點，最后篩選出候選致病突變位點。應(yīng)用SIFT、Polyphen-2及Mutation Taster預(yù)測候選基因序列變異所造成的氨基酸改變是否會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化。

4.Sanger測序驗證 經(jīng)上述分析后篩選出可能的候選致病突變位點，通過Sanger測序方法，對患兒及其父母外周血樣本進(jìn)行突變位點驗證，與外顯子測序結(jié)果進(jìn)行對比分析，并追溯突變來源。

結(jié) 果

一、患兒的基本情況

本研究共納入19例患兒，均有隱睪表現(xiàn)，其中單純隱睪4例，隱睪合并其他泌尿生殖系統(tǒng)畸形15例(其中2例為性別分化異常)。年齡6個月至11歲，均無家族史。

二、基因測序相關(guān)結(jié)果

1. 外顯子測序結(jié)果：19例中3例為全外顯子測序，16例為目標(biāo)基因外顯子測序。目標(biāo)區(qū)域覆蓋度達(dá)到98.5%以上，平均深度>10×者占比均在98%以上，提示基因組外顯子捕獲成功，測序質(zhì)量可靠。外顯子測序結(jié)果經(jīng)方法3中提及的生物信息學(xué)分析過濾篩選，發(fā)現(xiàn)3個基因可能與相關(guān)表型發(fā)病有關(guān)： ①AR基因發(fā)生3處錯義突變(c.1600C>A；p.Pro534Thr)、(c.2599G>A；p.Val867Met)和(c.528C>A；p.Ser176Arg)； ②NR5A1基因移碼突變(c.442delG； p.Glu148Serfs*148)和錯義突變(c.43G>A；p.Val15Met)； ③ATRX基因剪切位點突變(c.4317+13T>C)。結(jié)果詳見表1。

2. Sanger測序結(jié)果:外顯子測序經(jīng)過生物信息學(xué)分析篩選得到的6處突變位點均在Sanger測序的結(jié)果中得到證實。其中5例患兒母親存在對應(yīng)位點突變，患兒父親均未見異常，1例患兒(c.43G>A；p.Val15Met)父母均未見異常?；蛐蛄袌D詳見圖1至圖6。

三、基因型和表型的關(guān)系

AR基因突變：1例為單純左側(cè)腹股溝隱睪。基因測序(c.1600C>A；p.Pro534Thr)；1例為性分化異常。查體：外生殖器外觀與女性外陰相似，可見尿道開口及類似陰道口，雙側(cè)腹股溝區(qū)均可觸及睪丸樣組織。核型：46,XY。術(shù)后病理：雙側(cè)性腺均為睪丸組織。基因測序(c.2599G>A；p.Val867Met)；1例表現(xiàn)為左側(cè)腹股溝隱睪，陰莖短小，并有先天性巨結(jié)腸病史?；驕y序(c.528C>A；p.Ser176Arg)。

表1 基因測序陽性結(jié)果匯總Table 1 Phenotypes and significance of gene mutations患兒編號突變基因突變類型堿基改變 氨基酸改變臨床表現(xiàn)功能預(yù)測變異來源8AR錯義c.1600C>AP.Pro534Thr雙側(cè)腹股溝隱睪未知致病突變母10AR錯義c.2599G>AP.Val867Met雙腹股溝隱睪陰莖發(fā)育不良男性假兩性畸形已知致病突變母11AR錯義c.528C>AP.Ser176Arg右腹股溝隱睪陰莖短小未知致病突變母13NR5A1移碼c.442delGP.(Glu148Serfs*148)雙腹股溝隱睪尿道下裂(Ⅳ型)男性假兩性畸形未知致病突變母14NR5A1錯義c.43G>AP.Val15Met左腹股溝隱睪尿道下裂(Ⅲ型)已知致病突變患兒新發(fā)18ATRX剪切位點c.4317+13T>C-隱睪多發(fā)畸形功能無法預(yù)測臨床意義不明母

圖1AR基因： c.1600C>A； p.Pro534Thr (雜合,母來源)

Fig.1ARgene:c.1600C>A; p.Pro534Thr (heterozygous mutation,maternal)

圖2AR基因：c.2599G>A；p.Val867Met(雜合，母來源)

Fig.2ARgene:c.2599G>A; p.Val867Met (heterozygous mutation,maternal)

圖3AR基因：c.528C>A； p.Ser176Arg (雜合,母來源)

Fig.3ARgene variants:c.528C>A; p.Ser176Arg (heterozygous mutation,Maternal)

圖4NR5A1基因：c.442delG；p.Glu148Serfs*148(雜合,母來源)

Fig.4NR5A1gene:c.442delG.p.Glu148Serfs*148 (heterozygous mutation,maternal)

圖5NR5A1基因： c.43G>A；p.Val15Met (雜合，患兒新發(fā))

Fig.5NR5A1gene:c.43G>A; p.Val15Met (heterozygous mutation,newly onset)

圖6ATRX基因：c.4317+13T>C (雜合，母來源)

Fig.6ATRXgene:c.4317+13T>C (heterozygous mutation,maternal)

NR5A1基因突變:1例為雙側(cè)腹股溝隱睪，尿道下裂(Ⅳ型)，性別分化異常。查體：外生殖器外觀與女嬰相似，雙側(cè)腹股溝均可觸及睪丸樣腫塊。核型：46,XY。術(shù)后病理：雙側(cè)性腺均為睪丸組織?；驕y序(c.442delG； p.Glu148Serfs*148)；1例為左側(cè)腹股溝隱睪，尿道下裂(Ⅲ型)。核型：46,XY?；驕y序(c.43G>A；p.Val15Met)。

ATRX基因突變：患兒為雙側(cè)腹股溝隱睪、性腺發(fā)育不良，多發(fā)畸形(小頭畸形、右上眼瞼下垂、內(nèi)眥贅皮、耳廓大、鼻塌、智力落后、身體發(fā)育遲緩等)。核型：46,XY。基因測序(c.4317+13T>C)。

討 論

隱睪是常見的先天性男性泌尿生殖系統(tǒng)畸形之一。已有多個基因被證實與隱睪的發(fā)生有關(guān)，包括INSL3，LGR8/GREAT，HOXa10,AR,CGRP等[6]，但這些基因僅可解釋部分病因。性發(fā)育異常表現(xiàn)為染色體、性腺和附屬性器官的解剖學(xué)異常，其遺傳學(xué)病因復(fù)雜，且臨床表型多樣，正確的診斷和分類對于性別的認(rèn)定、生殖器的手術(shù)治療抉擇、社會撫養(yǎng)性別的選擇都起到非常重要的作用。

外顯子組測序僅針對人類基因組序列中1%的外顯子序列進(jìn)行檢測，具有經(jīng)濟(jì)、高效等特點，可更好地用于尋找致病基因和易感基因。外顯子測序技術(shù)可同時檢測多種基因，極大地提高了致病基因的檢出率，可快速、高效地做出分子病因診斷，為臨床干預(yù)提供依據(jù)。本研究通過外顯子測序技術(shù)，對不同表型患兒進(jìn)行基因測序分析。

雄激素是決定男性表型的重要激素，其作用主要由AR受體介導(dǎo)，AR基因變異會導(dǎo)致內(nèi)外生殖器表型顯著改變，甚至形成男性假兩性畸形[7,8]。雄激素不敏感綜合征(androgen insensitivity syndrome,AIS)是指因雄激素受體功能障礙引起的機(jī)體對雄激素出現(xiàn)不敏感甚至抵抗的一種疾病，而AR基因突變可導(dǎo)致AIS已有較為確鑿的證據(jù)。目前已有超過500個關(guān)于AR基因突變的報道，這些不同的突變導(dǎo)致了AR基因功能出現(xiàn)不同程度缺失，其中約90%為單堿基突變，且絕大部分為錯義突變[9]。

本研究中，1例表現(xiàn)為單純腹股溝隱睪，基因測序(c.1600C>A；p.Pro534Thr)；1例表現(xiàn)為性別發(fā)育異常(男性假兩性畸形)，基因測序(c.2599G>A；p.Val867Met)，考慮為AIS；1例為單純腹股溝隱睪合并陰莖短小、先天性巨結(jié)腸，基因測序(c.528C>A；p.Ser176Arg)。三種不同的突變引起了不同的臨床表型。目前認(rèn)為AR基因突變是AIS較為確切的病因之一，但這三種基因突變具體如何影響雄激素受體功能尚不明確，且各個突變造成的功能受限程度還有待進(jìn)一步研究。

類固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF1)又名核受體亞家族5組成員A1(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1,NR5A1)，是性腺和腎上腺中類固醇生成相關(guān)酶的主要調(diào)節(jié)者[10]。約有超過70個NR5A1基因突變已在多個DSD個體中被發(fā)現(xiàn)。在46,XY個體中，NR5A1基因參與男性性別決定和性別分化的過程，動物實驗表明，基因敲除后的小鼠表現(xiàn)為性腺發(fā)育障礙和性發(fā)育異常，而基因測序結(jié)果也證實性發(fā)育異常患兒存在NR5A1基因突變[11,12]。

本研究中，1例表現(xiàn)為性發(fā)育異常(男性假兩性畸形，社會性別女性)，基因測序(c.442delG; p.Glu148Serfs*148),突變導(dǎo)致編碼蛋白截短，功能預(yù)測具有致病性；1例表現(xiàn)為左側(cè)腹股溝隱睪，尿道下裂(陰囊型)，基因測序(c.43G>A; p.Val15Met)。該結(jié)果進(jìn)一步證實NR5A1基因是生殖器官發(fā)育調(diào)節(jié)過程中的重要基因，并參與睪丸下降過程。一些雜合性突變(如p.Glu11Ter、p.Cis16Ter和p.Glu51Argfs*23)在46,XY DSD、嚴(yán)重陰莖陰囊型尿道下裂和隱睪患者中分別被檢測出。據(jù)不完全統(tǒng)計，表現(xiàn)為不完全性腺發(fā)育不良的患者中，NR5A1基因的突變率約15%[13]。

ATR-X綜合征是一種X連鎖的嚴(yán)重智力發(fā)育障礙綜合征，以易辨認(rèn)的面部特征、生殖器發(fā)育異常和α-地中海貧血為主要表現(xiàn)。Gibbons和 Higgs報道，ATRX基因突變與泌尿生殖器發(fā)育不良存在相關(guān)性[14]。本研究中，患兒表現(xiàn)為多發(fā)畸形，其中泌尿生殖系統(tǒng)畸形主要表現(xiàn)為左側(cè)腹股溝隱睪、睪丸發(fā)育不良及尿道開口異常。而ARTX基因突變個體中存在性分化的異常，表現(xiàn)為隱睪并睪丸萎縮和尿道開口異常。在ART-X綜合征中生殖器異常的表現(xiàn)十分常見，可見于約80%的患者中。Aleksandra等報道，ATRX基因突變(c.G590>T,p.Cys197Phe)在1例ATR-X綜合征病例中表現(xiàn)出生殖系統(tǒng)異常。本組中陽性改變患兒表現(xiàn)為性腺發(fā)育不良及尿道下裂，表明此基因陽性改變造成的功能改變對泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響較大，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究共檢出3個基因的6處突變位點，其中4處為新發(fā)突變。AR、NR5A1基因突變可引起嚴(yán)重的性發(fā)育異常，臨床表型為外生殖女性化，進(jìn)一步證實46,XY DSD患者中AR、NR5A1基因突變的作用，同時ARTX基因也應(yīng)引起我們的重視。