龐 博，王倩倩，劉 舒，劉志強(qiáng)，宋鳳瑞，2*

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春質(zhì)譜中心&吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230026；3.南開大學(xué) 藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

黃芩為我國(guó)著名傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科多年生草本植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。中醫(yī)認(rèn)為黃芩性寒味苦，具有清熱解毒、止血、安胎等功效，對(duì)濕熱痞滿、黃疸、癰腫瘡毒、肺熱咳嗽、高熱煩渴等有良好療效[1]。黃芩中含有多種活性成分，黃酮類化合物作為其中的主要成分，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等。隨著對(duì)黃芩藥理作用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和保護(hù)心血管等作用[2-4]。此外，近期研究也發(fā)現(xiàn)黃芩具有較好的降血糖及治療糖尿病并發(fā)癥的作用[5-6]。α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20，α-Glucosidase)在生物體內(nèi)分布廣泛，在機(jī)體的多種生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，包括消化、糖蛋白合成、多糖及糖復(fù)合物的合成與分解等[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，α-葡萄糖苷酶與許多因代謝紊亂失調(diào)而引發(fā)的疾病(如糖尿病、肥胖癥、癌癥以及病毒感染等[8])密切相關(guān)。α-葡萄糖苷酶抑制劑則對(duì)該酶有很強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)在小腸局部發(fā)揮作用，可有效延緩飲食中碳水化合物的吸收，使餐后血糖峰值低平，趨于穩(wěn)定，從而降低血漿中的糖化血紅蛋白水平，發(fā)揮治療糖尿病的作用[9]。目前，已有α-葡萄糖苷酶抑制劑類化學(xué)藥物在臨床上用于治療糖尿病，而中藥資源豐富、高效低毒，具備篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的天然優(yōu)勢(shì)[10-11]。本研究以α-葡萄糖苷酶為生物靶點(diǎn)，利用微透析/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)比較與生物靶分子結(jié)合前后溶液中處于游離狀態(tài)藥物濃度的變化來(lái)推斷藥物與靶分子之間的結(jié)合強(qiáng)度。同時(shí)，透析液可以無(wú)需任何前處理步驟直接進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。利用該方法從黃芩提取物中篩選出10種α-葡萄糖苷酶抑制劑，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步研究黃芩治療糖尿病的作用機(jī)制、新藥研發(fā)，以及從其他中藥中篩選酶抑制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品、試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20,Sigma,USA)；醋酸銨購(gòu)于Sigma Chemical公司(St.Louis,MO,USA)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；乙腈、乙酸(色譜級(jí))購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；中藥材黃芩購(gòu)自北京同仁堂長(zhǎng)春藥店并經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，千層紙素A對(duì)照品購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

HX-200A型高速中藥粉碎機(jī)(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)；微透析系統(tǒng)：灌注器推進(jìn)泵(CMA 402 Syringe Pump)、灌注器(CMA 1.0 mL，MS-GAN100)、MAB85樣品自動(dòng)收集器、取樣探針MAB 7.8.10(截留分子量15 kD,膜長(zhǎng)10 mm)購(gòu)自Microbiotech/se AB公司；Waters H-class液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；LTQ XL線性離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芩水提物的制備黃芩粉碎后稱取藥材粉末25 g，加入10倍體積水浸泡20 min，加熱回流提取45 min，過(guò)濾，殘?jiān)谙嗤瑮l件下提取30 min，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至0.5 g/mL后冷凍干燥。所得黃芩提取物凍干粉末用甲醇溶解后制得生藥質(zhì)量濃度為100 mg/mL的儲(chǔ)備液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A適量，用甲醇溶解并定容配成1.0 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，再用甲醇稀釋各對(duì)照品儲(chǔ)備液制得質(zhì)量濃度均為50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.3 微透析篩選方法在EP管中添加適量α-葡萄糖苷酶液、黃芩提取物溶液和10 mmol/L NH4Ac緩沖溶液(pH 6.8)，總反應(yīng)體系為1.5 mL，黃芩提取物終濃度約為5 mg/mL，酶濃度約為10 U/mL，混勻后置于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min。然后將反應(yīng)體系取出，插入探針，在1.0 μL/min流速下，以反應(yīng)體系緩沖液(含10%甲醇)灌流，平衡90 min后采集樣品，每40 min采集一次，平行采集4個(gè)樣品后直接用于LC-MSn分析。以相同體積的10 mmol/L NH4AC緩沖液代替酶液作為空白對(duì)照組，空白對(duì)照組中其他溶液的加入量及處理、透析方法與上述相同。另外制備與空白對(duì)照組完全相同的樣品用于提取物中成分的回收率測(cè)定，該樣品不經(jīng)過(guò)透析，直接進(jìn)行LC-MSn分析。

1.2.4 色譜-質(zhì)譜條件液相色譜條件：迪馬C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，27%～35% A；10～20 min，35%～50% A；20～25 min，50%～60% A；25～30 min，60%～80% A；30～35 min，80%～100% A；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子檢測(cè)模式，掃描范圍為m/z100～1 000，噴霧電壓5.0 kV，毛細(xì)管溫度250 ℃，鞘氣流速(N2) 45 L/h，輔助氣流速90 L/h，金屬毛細(xì)管電壓32 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩與α-葡萄糖苷酶的相互作用

圖1為黃芩提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用以及不加酶的空白對(duì)照的液相色譜圖。由圖1可以看出在微透析篩選實(shí)驗(yàn)條件下，黃芩提取物中僅部分化合物能夠與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，通過(guò)比較峰面積的變化情況篩選出10種成分可以與α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生相互作用(表1)。

2.2 黃芩中與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)LC-MSn分析對(duì)黃芩提取物中10種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其保留時(shí)間、色譜峰歸屬以及ESI-MSn數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，1號(hào)峰和2號(hào)峰的保留時(shí)間分別為3.91 min和4.36 min，兩者的一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中均產(chǎn)生m/z549的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(圖2)，其分子量均為548，推測(cè)二者為一對(duì)同分異構(gòu)體。再經(jīng)二級(jí)及三級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜信息發(fā)現(xiàn)，二者均能產(chǎn)生m/z531、513、483、465等系列失水得到的碎片離子，但離子強(qiáng)度有所差異，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，推測(cè)1號(hào)峰為白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，2號(hào)峰為白楊素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。

圖2 化合物1和2在正離子模式下的質(zhì)譜圖

3號(hào)峰和4號(hào)峰的保留時(shí)間分別為8.52 min和10.76 min，其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+均為m/z447，推測(cè)二者為一對(duì)同分異構(gòu)體。MS2質(zhì)譜信息顯示，[M+H]+丟失分子量為176 Da的中性碎片，產(chǎn)生m/z271的碎片離子，推測(cè)176 Da的中性碎片可能為葡萄糖醛酸殘基；MS3質(zhì)譜條件下進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z253、225、169的碎片離子。根據(jù)與黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的串聯(lián)質(zhì)譜信息比對(duì)，并結(jié)合色譜保留時(shí)間，推定3號(hào)峰為黃芩苷，4號(hào)峰為漢黃芩素-5-O-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。

5號(hào)峰和6號(hào)峰的保留時(shí)間分別為11.31 min和13.00 min，在其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中[M+H]+均為m/z461，推測(cè)二者也為一對(duì)同分異構(gòu)體。在MS2質(zhì)譜信息中，二者的MS2均產(chǎn)生[M+H-176]+即m/z285的特征離子碎片，與丟失葡萄糖醛酸殘基相吻合；進(jìn)一步進(jìn)行MS3碎裂，發(fā)現(xiàn)二者均能產(chǎn)生丟失葡萄糖醛酸殘基和CH3基團(tuán)的碎片離子m/z270，由此證明其結(jié)構(gòu)中均含有甲氧基。結(jié)合保留時(shí)間、串聯(lián)質(zhì)譜信息以及對(duì)比文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]，推定5號(hào)峰為木蝴蝶素-7-O-葡萄糖醛酸苷，6號(hào)峰為漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(漢黃芩苷)。7號(hào)峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間為19.14 min，一級(jí)全掃描質(zhì)譜信息中[M+H]+為m/z271，其二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖中m/z253、243、225的碎片離子分別為丟失一個(gè)H2O，一個(gè)CO，以及同時(shí)丟失一個(gè)H2O和一個(gè)CO產(chǎn)生的。這些碎片信息與黃芩素對(duì)照品的串聯(lián)質(zhì)譜信息一致，因此推定7號(hào)峰為黃芩素。化合物5、6、7的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。

8號(hào)峰和10號(hào)峰的保留時(shí)間分別為25.26 min和26.71 min。一級(jí)全掃描質(zhì)譜信息中的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+均為m/z285，推測(cè)二者也為一對(duì)同分異構(gòu)體，在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖中，二者均產(chǎn)生[M+H-CH3]+即m/z270的特征離子碎片，說(shuō)明二者含有甲氧基。MS3碎裂發(fā)現(xiàn)二者所產(chǎn)生的碎片有明顯差異，根據(jù)保留時(shí)間、串聯(lián)質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，同時(shí)與漢黃芩素和千層紙素A的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的串聯(lián)質(zhì)譜信息比對(duì)，推定8號(hào)峰為漢黃芩素，10號(hào)峰為千層紙素A，結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。

9號(hào)峰的保留時(shí)間為25.81 min，其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z375，在MS2質(zhì)譜信息中的m/z360和m/z345碎片離子分別為[M+H-CH3]+和[M+H-2CH3]+。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果對(duì)比[14]，推定其為黃芩黃酮Ⅱ，結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。

表2 黃芩提取物中與α-葡萄糖苷酶結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)

2.3 探針的回收率及黃芩提取物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合率

在灌流液為含10%甲醇的醋酸銨溶液，灌流速度為1.0 μL/min的微透析實(shí)驗(yàn)條件下，以黃芩提取物在微透析前后色譜圖中各成分的峰面積之比計(jì)算其探針回收率。實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，探針膜的種類和長(zhǎng)度、灌流速度、實(shí)驗(yàn)溫度以及探針的幾何結(jié)構(gòu)等因素均會(huì)對(duì)回收率產(chǎn)生影響。

由圖1可知，黃芩提取物中有10種成分可與α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生相互作用。假設(shè)在不加入酶的對(duì)照組中藥物色譜峰積分面積為A，加入酶的實(shí)驗(yàn)組中藥物色譜峰積分面積為B，則藥物與酶的結(jié)合強(qiáng)度可表示為：Binding Degree(%)=(A-B)/A×100，用此計(jì)算方法可對(duì)體系中的各組分與生物靶分子的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行比較，本研究計(jì)算的黃芩提取物中10種成分的探針回收率以及與α-葡萄糖苷酶相互作用的結(jié)合率見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，黃芩提取物中篩選出的10種化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合率均不低于36.18%，表明黃芩提取物中的活性成分均與α-葡萄糖苷酶有良好的特異性結(jié)合。

表3 黃芩提取物中與α-葡萄糖苷酶結(jié)合化合物的探針回收率及結(jié)合率

3 結(jié) 論

本文以α-葡萄糖苷酶為生物靶點(diǎn)，通過(guò)微透析/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從黃芩提取物中篩選出10種α-葡萄糖苷酶抑制劑。該篩選方法能夠保證藥物與靶分子的作用體系始終處于溶液狀態(tài)，可真實(shí)反映藥物與靶分子的相互作用，且能夠避免藥物與膜間的非特異性作用干擾。利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)篩選出的抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，計(jì)算了此10種化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合率以及探針回收率。結(jié)果表明，黃芩中的黃酮類化合物均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可為進(jìn)一步研究黃芩治療糖尿病的藥理作用以及篩選高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑研究提供依據(jù)。