鞠 昀，張 洪，于 凱，姜 杰*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工和化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150090)

質(zhì)譜成像(Mass spectrometry imaging，MSI)是一種新型的分子成像技術(shù)，能夠可視化分析樣品區(qū)域指定質(zhì)量數(shù)的分子，獲得樣品表面待測(cè)物的相對(duì)含量及空間分布特征，已成為臨床醫(yī)學(xué)研究的重要利器和熱點(diǎn)[1]。其原理是在時(shí)間維度上對(duì)樣品表面進(jìn)行解吸電離，獲得樣本各像素點(diǎn)中待測(cè)物的離子強(qiáng)度，借助成像軟件重構(gòu)待測(cè)物在樣本中的二維或三維空間分布信息[2]。因此，MSI技術(shù)也被形象地稱為“分子顯微鏡”[3]。近年來，MSI取得了巨大進(jìn)步，已被廣泛應(yīng)用于生命、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。

惡性腫瘤已成為全球重大的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，目前在發(fā)病機(jī)制等方面已取得一定進(jìn)展和突破[4]，尋求能夠快速、高通量獲得腫瘤診斷、標(biāo)志物、藥物研發(fā)等相關(guān)分子信息的新技術(shù)、新手段仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來，分子病理結(jié)合質(zhì)譜成像技術(shù)已發(fā)展成為腫瘤研究的重要方法。與其它技術(shù)相比(如正離子斷層成像技術(shù)、磁共振波譜成像等)，MSI無需標(biāo)記或分子印染即能直接檢測(cè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的代謝物、脂類等，能夠獲得多點(diǎn)、多維、高通量、可視化的分子空間信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤類型、標(biāo)志物、藥物代謝等方面的研究[3,5-7]。本文主要介紹MSI的基本原理、特點(diǎn)及其在腫瘤病理診斷、標(biāo)志物及藥物研究等方面的應(yīng)用，并展望其潛在的發(fā)展方向。

1 質(zhì)譜成像技術(shù)

MSI的工作流程一般分為3個(gè)步驟：樣品制備、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。以小鼠的脊柱成像為例，首先采集樣本、處理并制作組織切片(圖1A)；隨后對(duì)樣品組織進(jìn)行網(wǎng)格劃分，采用成像技術(shù)分析，得到各像素點(diǎn)的質(zhì)譜圖(圖1B)；最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理(如基線校正、差異分析)，并使用成像軟件進(jìn)行重構(gòu)，從而獲得目標(biāo)分子在樣本中的可視化分布圖(圖1C)[8]。

圖1 質(zhì)譜成像過程示意圖[8]

1.1 質(zhì)譜成像技術(shù)分類

離子化技術(shù)的革新推動(dòng)著質(zhì)譜成像技術(shù)的發(fā)展，表1總結(jié)了MSI相關(guān)離子源及特點(diǎn)。MSI已由早期的基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)和二次離子質(zhì)譜(Secondary ion mass spectrometry，SIMS)發(fā)展到無需復(fù)雜樣品前處理的噴霧類(以解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)為代表)、等離子體類(以介質(zhì)阻擋放電電離(Dielectric barrier discharge ionization，DBDI)為代表)以及解吸/后電離類等。

表1 常見MSI離子源、特點(diǎn)及其空間分辨率

(續(xù)表1)

ClassificationNameCharacteristicsSpatialresolutionReferences微型輝光放電等離子體(Micro-fabricatedglowdischargeplas-ma,MFGDP)無污染、高靈敏度、尺寸小300μm[23]解吸/后電離類激光消融電噴霧電離(Laserablationelectrosprayionization,LAESI)可實(shí)現(xiàn)二維/三維空間成像分析30～100μm[24-26]紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離(Infraredlaserablationmeta-stable-inducedchemicalionization,IR-LAMICI)紅外激光提高了空間分辨率5～400μm[27]激光解吸-真空紫外單光子電離(Laserdesorptionpostioniza-tion,LDPI)電離效率高、穩(wěn)定性好100μm[28]空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像(Airflowassistedionizationmassspectrometryimaging,AFAI-MSI)適合大體積樣本分析、遠(yuǎn)距離傳輸300μm[29-30]液相微臨界表面取樣探針(Liquidmicrojunctionsurface-sam-pling,LMJ-SSP)探針位置與樣品位置需精確調(diào)節(jié)20～210μm[31-32]

1.2 常見質(zhì)譜成像技術(shù)

1.2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(MALDI-MSI)是目前應(yīng)用最廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù)[9]。其原理是以激光照射采用基質(zhì)處理過的組織切片，基質(zhì)從激光吸收能量，樣品分子得到基質(zhì)提供的電荷或反應(yīng)離子進(jìn)而發(fā)生電離。MALDI-MSI的解吸離子化過程與基質(zhì)的種類、激發(fā)波長、激光照射強(qiáng)度等有關(guān)。MALDI-MSI是一種軟電離技術(shù)，其靈敏度和鹽容忍度較好，空間分辨率可達(dá)10 μm左右[10]。主要用于多肽等生物分子的分析，在不同基質(zhì)輔助下也可用于藥物小分子的分析。常用的基質(zhì)包括2,5-二羥基苯甲酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸(DMCA)等[33]。

1.2.2 二次離子質(zhì)譜成像二次離子質(zhì)譜成像(SIMS-MSI)是利用高能初級(jí)離子束(例如Ar+、Au3+、C60+等)轟擊樣品表面，將初級(jí)離子的能量傳遞給組織表面待測(cè)物分子使其離子化，并進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)[11,34]。與MALDI-MSI相比，SIMS-MSI無需基質(zhì)，空間分辨率往往小于1 μm[12]。SIMI-MSI適用于檢測(cè)分子量在2 000 Da以內(nèi)的物質(zhì)，如小分子代謝物、脂質(zhì)等，較大的分子如多肽在分析過程中易被片段化，使得靈敏度顯著降低[35]。

1.2.3 解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像2004年，Cooks等在電噴霧電離基礎(chǔ)上發(fā)展了解吸電噴霧電離(DESI)，實(shí)現(xiàn)了常壓敞開式質(zhì)譜分析(Ambient ionization，AI)，同時(shí)也將質(zhì)譜成像分析從封閉環(huán)境拓展到大氣壓環(huán)境[14]。DESI的原理是在電場(chǎng)及鞘氣作用下，形成帶電微液滴并以一定的角度噴射到樣品表面，溶解樣品表面的待測(cè)物，使之在后續(xù)液滴作用下解離、離子化[36]。DESI-MSI的空間分辨率為200 μm左右[37]，在特定條件下對(duì)溶劑組成和流速等進(jìn)行優(yōu)化，空間分辨率可達(dá)40 μm左右[14]。隨著技術(shù)的改進(jìn)，以DESI-MSI為基礎(chǔ)的nano-DESI-MSI克服了樣品表面的擴(kuò)散現(xiàn)象，空間分辨率達(dá)到12 μm[15]。2008年，Prosolia公司推出了第一臺(tái)商業(yè)化DESI分子成像儀。2019年中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗(yàn)室潘洋等[18]開發(fā)了基于DESI的二次光電離質(zhì)譜成像技術(shù)(DESI-PI-MSI)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種極性和非極性組分的高靈敏度空間成像，空間分辨率達(dá)到50 μm。

1.2.4 介質(zhì)阻擋放電電離質(zhì)譜成像介質(zhì)阻擋放電電離源(DBDI)由張新榮等[19]于2007年提出，其原理為在兩放電電極之間放置絕緣介質(zhì)，施加交流電壓于電極，使充滿于兩電極間的惰性氣體或混合氣體電離形成穩(wěn)定的低溫等離子體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)載體上待測(cè)物的解吸離子化，DBDI已應(yīng)用于氨基酸、代謝物、藥物小分子等的分析。Cooks和歐陽證等共同開發(fā)了低溫等離子體槍(LTP)[21]，等離子體在噴嘴以射流狀噴出，調(diào)節(jié)電極結(jié)構(gòu)可避免細(xì)絲放電，適合氣、液、固等樣品和較大表面分析。隨后，張新榮等[20]將該方法用于質(zhì)譜成像分析，空間分辨率達(dá)到250 μm左右，且可通過改變毛細(xì)管內(nèi)徑進(jìn)一步降低。2017年，姜杰等在DBDI基礎(chǔ)上提出了表面脫附介質(zhì)阻擋放電電離源(SDDBDI)，采用納米尖端作為放電電極，質(zhì)譜入口接地，在兩電極間施加射頻高壓，從而可在質(zhì)譜入口和樣品表面形成穩(wěn)定等離子體。直線型的電場(chǎng)克服了樣品表面到質(zhì)譜入口樣品傳送效率低的問題，對(duì)氨基酸及藥物等的分析靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，空間分辨率降至22 μm[22]。

1.2.5 解吸/后電離組合類解吸/后電離類組合方式近年來被廣泛用于質(zhì)譜成像分析，包括激光消融電噴霧電離(LAESI)[24]、電噴霧輔助激光解吸電離(ELDI)[38]、紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離(IR-LAMICI)[27]、等離子體輔助激光解吸電離(PALDI)[39]、激光解吸-真空紫外單光子電離(LDPI)[28]、空氣動(dòng)力輔助離子化(AFAI)[29]、液相微臨界表面取樣探針(LMJ-SSP)[30]等。LAESI將激光解吸和ESI結(jié)合，利用激光對(duì)樣品消融解吸使待測(cè)物分子進(jìn)入氣相，并在ESI作用下被電離形成待測(cè)物離子，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)[24]。LAESI不僅可以實(shí)現(xiàn)樣本的二維分析，還可實(shí)現(xiàn)三維分析，空間分辨率可分別達(dá)到30～100 μm和30 μm[25-26]。IR-LAMICI將激光解吸與化學(xué)電離相結(jié)合，采用紅外激光消融解吸樣品表面的待測(cè)物使其進(jìn)入氣相，并與亞穩(wěn)態(tài)的氣體分子相互作用實(shí)現(xiàn)離子化，空間分辨率可達(dá)5 μm[27]。劉虎威等[39]將多波長激光解吸與等離子體源結(jié)合提出了PALDI質(zhì)譜成像法，該方法可以在沒有任何樣品預(yù)處理的環(huán)境條件下完成，與其他環(huán)境MSI相比，空間分辨率有了很大的提高，達(dá)到60 μm×60 μm。LDPI采用紫外單光子電離目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)離子化[28]，減少了基質(zhì)對(duì)成像的干擾，通過解耦、解吸和電離，將電離效率的波動(dòng)最小化，空間分辨率可達(dá)到100 μm。AFAI是再帕爾·阿不力孜等自主研發(fā)的新型常壓敞開式離子化技術(shù)[29],該方法利用空氣流實(shí)現(xiàn)了離子或帶電液滴在大氣壓中的遠(yuǎn)距離傳輸，在質(zhì)譜入口處富集帶電液滴，提高了離子化效率。AFAI技術(shù)尤其適合于大體積物品分析和遠(yuǎn)距離目標(biāo)物傳輸，空間分辨率可達(dá)300 μm[30]。LMJ-SSP[30]由兩共軸的毛細(xì)管組成，溶劑通過中間的缺口萃取樣品表面待測(cè)物并傳遞到質(zhì)譜入口，在ESI或APCI作用下電離，該方法空間分辨率為20～210 μm[32]。圖2為幾種常見MSI離子源示意圖。

圖2 幾種常見MSI離子源示意圖

2 MSI在腫瘤中的應(yīng)用

2.1 識(shí)別腫瘤組織病理特征

獲取腫瘤與正常組織的差異分子特征有助于了解腫瘤發(fā)展過程和臨床治療，MSI可用于區(qū)分病變部位中的腫瘤分布和腫瘤的病理類型，對(duì)腫瘤的臨床醫(yī)學(xué)診斷具有重要意義。趙南勛等[40]采用MALDI-MSI對(duì)卵巢癌組織進(jìn)行成像分析，質(zhì)譜成像結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果吻合，揭示了腫瘤和正常組織及邊界區(qū)域獨(dú)特的多肽譜。胡勇軍等[41]利用LDPI-MSI對(duì)上皮癌組織進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中葉酸信號(hào)強(qiáng)度明顯高于鄰近的正常組織，葉酸含量可以指示上皮癌組織邊界。陳杰等[42]采用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧質(zhì)譜成像(AFADESI-MSI)對(duì)肺癌的癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在癌變組織中發(fā)現(xiàn)了多種內(nèi)源性代謝物(如磷脂、多肽、氨基酸等)，為肺癌的臨床診斷提供了有力方法。再帕爾·阿不力孜等[43]利用AFAI-MSI在正負(fù)模式下分別對(duì)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)原位癌和各種亞型進(jìn)行了成像分析，結(jié)果表明浸潤性導(dǎo)管癌的磷脂含量比導(dǎo)管內(nèi)原位癌高，而導(dǎo)管內(nèi)原位癌的脂肪酸含量比浸潤性導(dǎo)管癌高，采用AFAI-MSI可以對(duì)乳腺癌進(jìn)行快速鑒定分類，以指導(dǎo)手術(shù)切除。

2.2 腫瘤標(biāo)志物篩查

MSI技術(shù)可用于檢測(cè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的脂質(zhì)、代謝物等，已成為識(shí)別腫瘤生物標(biāo)志物的重要工具。目前，已通過MSI技術(shù)在乳腺癌[42]、甲狀腺癌[44]、結(jié)腸癌[45]等癌癥中發(fā)現(xiàn)了新的潛在生物標(biāo)志物，為腫瘤診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后研究提供了有力依據(jù)。陳杰等[42]采用AFAI-MSI技術(shù)在正負(fù)模式下分別對(duì)乳腺腫瘤組織樣品進(jìn)行成像分析，篩選出29個(gè)可用于乳腺腫瘤分類的脂質(zhì)分子，16個(gè)可用于乳腺腫瘤分級(jí)的脂質(zhì)分子。李智立等[44]采用MALDI-MSI對(duì)惡性甲狀腺癌及正常的癌旁組織中的脂類代謝物進(jìn)行成像分析，結(jié)果表明磷脂酸在甲狀腺癌中的分布相比于正常組織顯著增多。麥富德等[45]利用MALDI-MSI對(duì)胃腫瘤組織進(jìn)行成像分析，結(jié)果顯示胃腫瘤組織中中性粒細(xì)胞肽1-3(HNPs 1-3)的表達(dá)水平明顯高于鄰近正常組織，并且主要肽HNPs-1在腫瘤組中從早期到晚期有所增加，證實(shí)HNPs 1-3對(duì)胃腫瘤病變過程具有重要意義。郭寅龍等[46]采用MALDI-MSI對(duì)甲狀腺癌組織中的磷脂(PLs)和脂肪酸(FFAs)進(jìn)行成像分析，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中FFAs和PLs的強(qiáng)度明顯高于甲狀腺癌旁組織；采用相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FFAs的從頭合成在甲狀腺癌組織中比癌旁組織中更加活躍，進(jìn)一步揭示了脂質(zhì)的差異代謝與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。綜上表明，MSI技術(shù)無需標(biāo)記即可多組分同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的篩查具有重要意義。

2.3 腫瘤藥物研究

MSI不僅可以反應(yīng)用藥后各腫瘤細(xì)胞器官中藥物的分布情況，還能提供藥物代謝物信息及其含量變化規(guī)律，對(duì)于腫瘤藥物的評(píng)估具有重要意義。鞠熀先等[47]以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型，采用MALDI-MSI研究了抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)的活性及作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX能夠促進(jìn)半胱天冬酶的形成，而半胱天冬酶的激活能夠誘導(dǎo)癌變細(xì)胞死亡。再帕爾·阿不力孜等[48]利用AFAI-MSI研究了抗腫瘤候選新藥右旋娃兒藤寧堿(S-(+)-Deoxytylophorinidine，CAT)及其主要代謝物在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CAT的調(diào)控、藥效、毒性作用與膽堿的分布及變化密切相關(guān)。劉欣等[49]利用MALDI-MSI研究了腫瘤藥物伊立替康及其代謝物在結(jié)直腸腫瘤器官(CTOs)中的空間分布，顯示用藥后24 h CTOs內(nèi)的伊立替康由起初的邊緣滲透到腫瘤中心區(qū)域，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)伊立替康處理后的結(jié)直腸腫瘤的增殖明顯減緩，證明了伊立替康能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。劉曉輝等[50]利用MALDI-MSI對(duì)患有腦腫瘤的小鼠進(jìn)行BKM120給藥處理( BKM120是一種泛Ⅰ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的小分子抑制劑)，并獲取了藥物從腦血管滲透進(jìn)入到腦實(shí)質(zhì)的質(zhì)譜成像結(jié)果，說明該藥物能夠透過血腦脊液屏障并靶向腦腫瘤區(qū)域，是腦腫瘤治療的有效藥物。Gharpure等[51]采用DESI-MSI對(duì)他莫西芬治療卵巢癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4)是參與游離脂肪酸攝取的關(guān)鍵物質(zhì)，他莫西芬可以抑制FABP4的形成，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移。綜上表明，MSI是腫瘤組織內(nèi)藥物傳遞、代謝物及作用機(jī)理等方面研究的重要工具，因其具有無需標(biāo)記即可獲得多組分信息的優(yōu)勢(shì)，為腫瘤藥物的研究提供了一種新方法、新手段。

3 展 望

近年來，MSI作為一種新型的分子成像技術(shù)，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。與其它技術(shù)相比(如正離子斷層成像技術(shù)、磁共振波譜成像等)，MSI無需標(biāo)記或分子印染即能夠獲得多點(diǎn)、多維、高通量、可視化的分子空間信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤類型、標(biāo)志物、藥物代謝等方面的研究。通過MSI分析，可以將腫瘤樣本的分子信息、等級(jí)等可視化，有助于腫瘤的診斷、治療；并可通過可視化篩查潛在分子標(biāo)志物、相關(guān)藥物研究等。此外，MSI技術(shù)在術(shù)中腫瘤切除、邊界確認(rèn)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

雖然MSI得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用，但以下幾方面仍有待進(jìn)一步研究，以便充分挖掘其分析性能和適用范圍：(1)隨著MSI的快速擴(kuò)展，迫切需要改進(jìn)樣品制備水平的重現(xiàn)性；(2)高空間分辨率會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，可能使得某些物質(zhì)信號(hào)丟失，需要優(yōu)先考慮高空間分辨率還是高靈敏度；(3)質(zhì)譜成像檢測(cè)的通量以及時(shí)效性需進(jìn)一步提升；(4)腫瘤細(xì)胞變化復(fù)雜，給篩選有效標(biāo)志物帶來困難，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物和藥物需要進(jìn)行更深層次的探究和臨床驗(yàn)證。