鄭天宇，彭帥，楊小玲，朱雪蕾，吳慧昊

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

酸奶是以牛（羊）乳或乳粉為主要原料，殺菌后添加乳酸菌發(fā)酵而成的發(fā)酵乳制品[1]。因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)多年來(lái)一直受到廣大消費(fèi)者的青睞[2]。它不僅保留了牛乳中所有的營(yíng)養(yǎng)成分，而且還因發(fā)酵作用產(chǎn)生大量的乳酸及有益于人體健康的活性乳酸菌[3]。酸奶能有效促進(jìn)人體消化，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)乳糖的吸收[4]，促進(jìn)機(jī)體物質(zhì)代謝及維持腸道內(nèi)菌群的平衡，經(jīng)常飲用酸奶具有提高人體免疫力、降低血中膽固醇等功效[5～8]。而且酸奶發(fā)酵過(guò)程中，牛奶中的糖和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分有20%左右被分解成小分子，更易消化和吸收，各種養(yǎng)分的利用率也得以提高[9]。

發(fā)酵劑是決定發(fā)酵乳制品品質(zhì)的重要因素，也是酸奶產(chǎn)酸和產(chǎn)香的基礎(chǔ)和關(guān)鍵因素。酸奶質(zhì)量的好壞主要取決于酸奶發(fā)酵劑的品質(zhì)類型及活力[10]。甘肅省有豐富的牛乳資源，當(dāng)?shù)啬撩裱匾u傳統(tǒng)的方法制作的乳酸奶產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，組織狀態(tài)細(xì)膩，口感優(yōu)良，牧民經(jīng)常食用，大多健康長(zhǎng)壽[11]。這表明當(dāng)?shù)厮崤Ｈ橹杏行阅軆?yōu)良的乳酸菌群[12]。本研究采集牧民傳統(tǒng)制作的酸牛乳與泡菜，對(duì)其中的乳酸菌種進(jìn)行分離純化及發(fā)酵性能的測(cè)定，以期篩選出性能優(yōu)良的乳酸菌菌株用于酸奶生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：厭氧微生物實(shí)驗(yàn)室保存的菌株：植物乳桿菌、雙歧桿菌、戊糖片球菌、戊糖乳桿菌、ZT010T；分離自泡菜制品、牧民自制酸奶的乳酸菌株。

1.1.2 原料：純牛乳。

1.1.3 培養(yǎng)基：

乳酸細(xì)菌（MRS）液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-80 1.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、蒸餾水1L，pH6.6-6.8，1×105Pa滅菌20min。MRS固體培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20g/L碳酸鈣、17.5g/L瓊脂。

1.1.4 儀器與設(shè)備

M L S-3 7 5 0 全自動(dòng)高壓滅菌器（J A P A N SANYO），GL-21M高速冷凍離心機(jī)（賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。BX51T-32P01 數(shù)碼光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS .JAPAN）；1285 生物安全柜（Thermo Electron Corporation）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

采自甘肅省甘南州牧民家庭自制酸奶及泡菜制品，共采集5份。取樣后將其放入無(wú)菌瓶中，儲(chǔ)存于冰盒中，并于48h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室用于菌株的分離、篩選。

1.2.2 發(fā)酵菌的分離及純化

取乳樣及泡菜制品各1mL，采用梯度稀釋法將酸奶稀釋至10-8，將泡菜制品稀釋至10-6。取0.2mL稀釋樣品，平板涂布于含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上。于37℃倒置培養(yǎng)，48h后觀察菌株生長(zhǎng)情況。在培養(yǎng)基中挑選具有明顯透明圈的菌落進(jìn)行分離和純化。并記錄下培養(yǎng)基菌落總數(shù)。

根據(jù)菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、邊緣、光澤）對(duì)菌落進(jìn)行命名[13]，挑選形態(tài)不同的菌落在MRS瓊脂培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化培養(yǎng)直至鏡檢為純菌株[14]。將純化菌株置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 純化菌株的形態(tài)學(xué)觀察

挑純化后的菌落進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，通過(guò)簡(jiǎn)單染色鏡檢圖片記錄各個(gè)菌落形態(tài)特征。

1.2.4 酸奶生產(chǎn)的簡(jiǎn)要工藝流程

純牛乳→殺菌(煮至微沸)→ 冷卻(室溫)→分裝→接菌→封口→發(fā)酵→ 后熟及冷藏(4℃)→成品[15]。

1.2.5 菌株初篩

將分離菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化后，以16%的接菌量接種于純牛乳中，發(fā)酵培養(yǎng)，記錄下凝乳時(shí)間、凝乳外觀及乳清析出量。淘汰活力差、凝乳性能不好的菌株，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[16]。

1.2.6 不同菌株發(fā)酵酸奶感官綜合評(píng)定

將初篩選定的菌株分別以16%的接菌量接種于滅菌的純牛乳中，發(fā)酵至凝乳，凝乳后后熟冷藏發(fā)酵24h，由10名食品專業(yè)人員（男女各半）品嘗鑒別，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為產(chǎn)品的特征，包括表層外觀、組織狀態(tài)、口感、乳清的析出等。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[17]。

1.2.7 不同溫度下菌株發(fā)酵性能對(duì)比

將初篩選定的菌種以16%的接菌量接種于純牛乳中，將其分別放置在37℃、40℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。凝乳后按照發(fā)酵乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比不同溫度下菌株發(fā)酵性能的差異。

表2 分離菌株形態(tài)特征

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離結(jié)果

從牧民家庭采集的發(fā)酵乳樣本及泡菜制品中共分離出6株發(fā)酵菌，其中桿菌4株、球菌2株，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行染色觀察，具體結(jié)果見(jiàn)表2。圖1～3為選取分純菌中具有代表性形態(tài)特征菌株圖片。

圖2 桿C（10×100）

圖3 桿D（10×100）

2.2 初級(jí)篩選結(jié)果

以分離活化出的6株乳酸菌及實(shí)驗(yàn)室保存的5株菌制備酸奶。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果表現(xiàn)，淘汰發(fā)酵過(guò)程中活力弱、凝乳性能不好、發(fā)酵性能差的菌株，最終篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的5株菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5株菌分別為植物乳桿菌、戊糖片球菌、ZT010T、雙歧桿菌、桿A。菌株發(fā)酵效果如表3所示，酸奶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。

2.3 不同溫度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將初篩獲得的5株菌種按照16%的接菌量接種于純牛乳中，接種后的牛乳分別放到37℃、40℃發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。凝乳后對(duì)其組織狀態(tài)、滋味及風(fēng)味、色澤等指標(biāo)做出評(píng)定[18]，按照表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，取其平均值[19-20]。結(jié)果如表4、表5所示。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

表3 菌株發(fā)酵效果

圖4 酸奶發(fā)酵結(jié)果

由表4可以得出，37℃發(fā)酵時(shí)，5種菌株發(fā)酵酸奶都具有較為良好的發(fā)酵性能：雙歧桿菌和ZT010T凝乳時(shí)間長(zhǎng)，組織狀態(tài)較差，口感粗糙；植物乳桿菌、戊糖片球菌以及桿A凝乳時(shí)間較短，有發(fā)酵香味且口感細(xì)膩，雙歧桿菌和植物乳桿菌均無(wú)乳清析出且發(fā)酵色澤優(yōu)良，戊糖片球菌、ZT010T、桿A均有少量乳清析出，戊糖片球菌以及ZT010T有結(jié)塊現(xiàn)象，桿A色澤程度較其他發(fā)酵菌差。

表4 37℃發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

圖5 37℃發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

由表5可以看出，在40℃發(fā)酵時(shí)，5種菌株發(fā)酵結(jié)果較37℃都有所改善，雙歧桿菌發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，產(chǎn)酸能力較好，組織狀態(tài)較好；植物乳桿菌、ZT010T發(fā)酵時(shí)間較短，口感細(xì)膩，組織狀態(tài)光滑，色澤優(yōu)良；戊糖片球菌、桿A發(fā)酵時(shí)間也較短，色澤較好，產(chǎn)酸性能優(yōu)良。

表5 40℃發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

圖6 40℃發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

通過(guò)兩種溫度下酸奶發(fā)酵效果對(duì)比可以看出：37℃下凝乳時(shí)間與40℃相比有一定差異性，后者比前者在發(fā)酵時(shí)間上有一定程度的縮短。其中ZT010T前后差異較為顯著。雙歧桿菌是所有實(shí)驗(yàn)菌種中發(fā)酵時(shí)間最長(zhǎng)的，但當(dāng)溫度改為40℃時(shí)，發(fā)酵時(shí)間也在一定程度上被縮短。ZT010T在不同溫度前后的變化結(jié)果表明，升高溫度在一定程度上可以改善乳清析出量以及組織狀態(tài)。兩組溫度下感官綜合評(píng)分結(jié)果對(duì)比表明，40℃發(fā)酵的酸奶色澤均勻一致、口感細(xì)膩、有濃郁的酸奶風(fēng)味且?guī)缀鯚o(wú)乳清析出，各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)分較高，更為可口。

3 結(jié)論

從甘肅牧民家庭采集的酸牛乳及泡菜制品中共分離出6株乳酸菌，初篩后加上實(shí)驗(yàn)室保存菌種共得到5株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌種。這5株菌凝乳時(shí)間較短、生長(zhǎng)活力較強(qiáng)、乳清析出較少。將分純后的菌株分別在37℃以及40℃接入純牛乳中發(fā)酵培養(yǎng)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：溫度波動(dòng)對(duì)酸奶發(fā)酵特性和品質(zhì)有影響。40℃發(fā)酵可以改善酸奶的乳清析出量、組織狀態(tài)以及酸奶的風(fēng)味，其感官總評(píng)分高于37℃時(shí)發(fā)酵總評(píng)分。