周輝芳， 隗和儒， 馬士朝， 張超群， 王君平， 楊新英， 謝 英， 孫殿興

1 河北醫(yī)科大學研究生學院， 石家莊 050017； 2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院全軍肝病中心， 石家莊 050082； 3 承德醫(yī)學院， 河北 承德067000；4 河北醫(yī)科大學實驗動物學部 河北省實驗動物重點實驗室，石家莊 050017

膠原三股螺旋重復蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)是一種組織修復過程中分泌的外分泌蛋白，參與受損后的血管重塑修復過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CTHRC1可以參與到多種實體腫瘤細胞的發(fā)生與進展過程，如肝癌[1]、卵巢癌[2]、宮頸鱗狀細胞癌[3]、骨肉瘤[4]等，并與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。microRNA(miRNA，簡寫為miR)是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼RNA。這些核苷酸通過與目標信使RNA(mRNA)的3′端非編碼區(qū)域結(jié)合來實現(xiàn)對目標基因的調(diào)節(jié)。在人類腫瘤中，miR-30b已被證實是一種在癌癥發(fā)病機制中起著重要作用的腫瘤抑制基因，但在少數(shù)情況下發(fā)揮類似致癌基因的作用[5-6]。為進一步研究CTHRC1與miR-30b在人肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移方面的作用，本研究首先構(gòu)建pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表達載體，在此基礎(chǔ)上，驗證了CTHRC1與miR-30b的關(guān)系，為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自美國Gibico公司；Q5@ PCR Master Mix (2X)購自英國NEB公司；Gene Ruler 1 kb DNA Ladder購自美國Thermo Scientific公司；T4連接酶、NheⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、感受態(tài)細胞E.coli Competent Cells購自大連TaKaRa公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；真核表達載體pIRES2-EGFP為本實驗室保存；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit、miRNeasy Mini Kit和miScript PCR Starter Kit購自德國QIAGEN公司；引物由上海生工公司合成；has-miR-30b-5p mimic與Negative control由廣東銳博生物科技有限公司提供；兔抗人CTHRC1多克隆抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 細胞和細胞培養(yǎng) 293T細胞、人肝癌細胞Huh7和HepG2均為本實驗室保存。在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的濕潤條件下培養(yǎng)，細胞每隔2 d傳代1次。

1.3 CTHRC1目的基因克隆 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找CTHRC1 CDS+3′UTR區(qū)序列(登錄號: NM_001256099.2)，委托上海生工公司合成克隆至pUC57載體。設(shè)計引物，上游引物F：5′-GACACGCTAGCATGTGGCCGCCAGGT-3′(含NheⅠ酶切位點)，下游引物R：5′-GTGTCCTCGAGTTATTTAAAGATATTA-3′(含XhoⅠ酶切位點)，產(chǎn)物長度為1095 bp。以含有CTHRC1 CDS+3′UTR區(qū)的合成序列為模板，用F/R特異性引物PCR擴增，NheⅠ/Xho Ⅰ 雙酶切，回收純化，克隆至pIRES2-EGFP載體。

1.4 載體構(gòu)建 NheⅠ/XhoⅠ雙酶切載體pIRES2-EGFP和1095 bp的CTHRC1 PCR產(chǎn)物(見1.3)，行1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，切膠回收載體及DNA片段。按照TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2 .0試劑盒說明書配制連接體系, 將CTHRC1 DNA片段與pIRES2-EGFP真核表達載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α E.coli Competent Cell，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取陽性克隆。質(zhì)粒進行小量制備，雙酶切鑒定并送上海生工公司測序。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 分別將293T、Huh7和HepG2細胞接種于6孔板，每孔接種1×105細胞，待細胞匯合度約80%時，用PBS洗滌2次，然后換上無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基500 μl。將脂質(zhì)體Lipofectamine 3000與質(zhì)粒分別與250 μl無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基混合，5 min后再將兩者混合，室溫孵育15 min后均勻加入待轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)48 h后換成DMEM完全培養(yǎng)基，計算轉(zhuǎn)染效率。取5個不同視野分別計數(shù)表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)和總細胞數(shù)，按下列公式計算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率=(熒光顯微鏡下細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.6 Western Blot檢測CTHRC1蛋白表達 miR-30b mimic、control、pCTHRC1-IRES2-EGFP質(zhì)粒和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，于轉(zhuǎn)染48 h后，收取轉(zhuǎn)染效率達85%以上的細胞制備蛋白，常規(guī)進行Western Blot實驗，檢測CTHRC1蛋白表達水平的變化。

1.7 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-30b表達 293T細胞中轉(zhuǎn)染miR-30b mimic、control、pCTHRC1- IRES2- EGFP質(zhì)粒和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后收取轉(zhuǎn)染效率達85%以上的細胞，使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)從細胞中提取RNA，使用miScript PCR Starter Kit(QIAGEN)逆轉(zhuǎn)錄及定量檢測miR-30b表達水平，具體方法參照試劑說明書。has-miR-30b-5p引物由美國GeneCopoeia公司提供(Cat# HmiRQP0393)；內(nèi)參U6引物由德國QIAGEN公司提供(Lot No.160026679)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算miR-30b相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CTHRC1 PCR擴增產(chǎn)物及pIRES2-EGFP雙酶切產(chǎn)物 以CTHRC1 CDS+3′UTR合成序列為模板，用含有酶切位點的特異性引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，結(jié)果示回收片段約1100 bp；用NheⅠ、XhoⅠ雙酶切pIRES2-EGFP后，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，回收約5300 bp的片段(圖1)。

注：a，1為DL2000 DNA標準參照物，2為NheⅠ、XhoⅠ雙酶切CTHRC1 PCR產(chǎn)物；b，1為1 kb DNA標準參照物，2為載體pIRES2-EGFP，3為NheⅠ、XhoⅠ雙酶切pIRES2-EGFP。

圖1CTHRC1PCR擴增產(chǎn)物及質(zhì)粒pIRES2-EGFP的雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒兩個條帶的大小分別為5300 bp和1100 bp，與預期結(jié)果一致, 均應為陽性克隆(圖2)?；蛐蛄袦y定結(jié)果顯示序列與GeneBank公布序列完全一致。載體構(gòu)建完全正確，符合下一步實驗設(shè)計要求。

注：1，DL15000 DNA標準參照物；2，載體pIRES2-EGFP；3，NheⅠ、Xho Ⅰ 雙酶切pIRES2-EGFP；4，重組質(zhì)粒pCTHRC1-IRES2-EGFP；5，Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ 雙酶切pCTHRC1-IRES2-EGFP；6，DL2000 DNA標準參照物。

圖2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 轉(zhuǎn)染效果評價 將2 μg和4 μg的pCTHRC1-IRES2-EGFP質(zhì)粒分別與6 μl和12 μl的Lipofectamine 3000混合轉(zhuǎn)染Huh7及HepG2細胞，48 h后于熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率分別為90%、89%和85%、83%。結(jié)果表明，2 μg質(zhì)粒和6 μl Lipofectamine 3000混合可達到最大的轉(zhuǎn)染效率(圖3)。

2.4 CTHRC1基因表達與miR-30b表達水平分析 與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-30b mimic及pCTHRC1-IRES2-EGFP質(zhì)粒明顯提高了miR-30b及CTHRC1水平(t值分別為9.960、25.238，P值均<0.05)(圖4a、d)。此外，過表達CTHRC1組中miR-30b水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.457，P<0.05)(圖4b)；miR-30b組與對照組相比，CTHRC1表達水平明顯下降(t=-24.677，P<0.05)(圖4c)。

注：a，Huh7細胞白光拍攝；b，Huh7細胞熒光拍攝；c，HepG2細胞白光拍攝；d， HepG2細胞熒光拍攝。

圖3轉(zhuǎn)染效果驗證(×100)

注:a，has-miR-30b-5p mimic (miR-30b)與Negative control (control)轉(zhuǎn)染至293T細胞中miR-30b的表達；b，pCTHRC1-IRES2-EGFP (CTHRC1)質(zhì)粒與pIRES2-EGFP (NC)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中miR-30b的表達；c，miR-30b與control轉(zhuǎn)染至293T細胞中CTHRC1的表達；d， CTHRC1質(zhì)粒與NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中CTHRC1的表達。

圖4CTHRC1與miR-30b的表達分析

3 討論

CTHRC1是一種28 kD的細胞外基質(zhì)糖蛋白，含有作用細胞外分泌的NH2末端信號肽，36個氨基酸的短膠原三螺旋重復序列和COOH末端球狀結(jié)構(gòu)域[7]。最近的研究表明，CTHRC1在多種侵襲性腫瘤中上調(diào)，包括胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9]以及胰腺癌[10]。這些研究表明，CTHRC1是腫瘤微環(huán)境中腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]，但其在肝癌中的研究較少。miR-30b在多種腫瘤中表達異常，近年來，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR-30b表達下調(diào)，如肝癌[12]、非小細胞肺癌[13]、結(jié)直腸癌[14]、胃癌[15]、食管癌[16]、乳腺癌[17]、喉癌[18]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[19],但其在肝癌進程中的機制尚不清楚。為進一步研究CTHRC1是否為miR-30b的靶標，并對人肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移方面的作用，本研究構(gòu)建pCTHRC1-IRES2-EGFP 真核表達載體，然后分別將miR-30b mimic、control、pCTHRC1-IRES2-EGFP質(zhì)粒和pIRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中，48 h后檢測CTHRC1蛋白及miR-30b的表達水平，結(jié)果顯示過表達CTHRC1組中miR-30b的表達水平下降(P<0.05)；miR-30b表達升高則導致CTHRC1表達下降(P<0.05)，這些數(shù)據(jù)提示CTHRC1基因表達與miR-30b的水平呈負相關(guān)。需進一步研究明確CTHRC1可能為miR-30b的靶基因，并為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染通過靜電作用與被轉(zhuǎn)染的目的片段相結(jié)合，便于攜帶外源基因入細胞, 而且進入細胞后可被細胞降解, 無明顯毒副作用和免疫反應產(chǎn)生[20]；且脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導的轉(zhuǎn)染操作簡單。miRNA是通過作用于基因的3′非編碼區(qū)域結(jié)合來實現(xiàn)對目標基因的調(diào)節(jié)，故本實驗采用特異性引物PCR擴增含有CTHRC1 CDS+3′UTR區(qū)序列的pUC57載體，擴增產(chǎn)物雙酶切、回收克隆至pIRES2-EGFP真核表達載體，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞。

本實驗中所構(gòu)建的載體pIRES2-EGFP除具備真核表達載體的一般特征外，還具備以下特點：EGFP基因編碼區(qū)可表達EGFP，EGFP較野生型的GFP熒光更強，在哺乳動物細胞中有更高的表達，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，還可以通過流式細胞儀對陽性細胞進行分選；在多克隆位點與EGFP基因區(qū)之間存在IRES區(qū)，可以使外源基因和EGFP基因同步表達。因此, 本實驗選取該載體構(gòu)建真核表達載體用于人肝癌細胞的進一步研究。

筆者根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的CTHRC1 CDS+3′UTR區(qū)合成序列為模板，采用特異性引物PCR擴增并成功將其克隆至pIRES2-EGFP載體中，并對目的片段進行測序，以確保重組載體的質(zhì)量。重組體被整合到宿主細胞基因組后，通過抗性輔助篩選單克隆細胞，并初步驗證了CTHRC1與miR-30b的關(guān)系，為下一步檢測CTHRC1與miR-30b的相互作用及其在人肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移方面的作用，進而對以CTHRC1為靶點的人肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。