孔令霞，陳先俠

隨著國(guó)家二胎政策的全面放開(kāi)，生育人數(shù)明顯增加，其中高齡產(chǎn)婦更是逐年增加。隨著孕婦人數(shù)及妊娠年齡等方面的增長(zhǎng)，各種胎兒疾病如唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征等染色體非整倍體疾病的發(fā)病率也隨之增加。自1997年在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)以來(lái)[1]，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)便開(kāi)始逐漸取代傳統(tǒng)的血清生化標(biāo)志物篩查[2]以進(jìn)行產(chǎn)前診斷[3]。隨著新一代基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，使得cffDNA在妊娠早期產(chǎn)前診斷的篩查中得到廣泛應(yīng)用。本文就孕婦外周血cffDNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用與發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 孕婦外周血中cffDNA的發(fā)現(xiàn)與來(lái)源

1.1cffDNA的發(fā)現(xiàn) 1969年Walknowska等[4]研究表明胎兒淋巴細(xì)胞的母體轉(zhuǎn)移很常見(jiàn)，可以通過(guò)母體血液中淋巴細(xì)胞的核型分析來(lái)進(jìn)行男性胎兒的產(chǎn)前診斷，同時(shí)也可以識(shí)別胎兒染色體異常。1997年Lo等[1]通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)出懷有男性胎兒的孕婦血清和血漿中均有男性胎兒Y染色體DNA序列，同時(shí)cffDNA的含量與孕周密切相關(guān)，最早可在妊娠第5周通過(guò)定量PCR技術(shù)在母體外周血中檢測(cè)出cffDNA，并在妊娠第7周與母體建立完整的胎盤(pán)循環(huán)，其含量隨孕周的增加而增加，這一發(fā)現(xiàn)為孕婦外周血中cffDNA作為產(chǎn)前檢測(cè)手段提供了重要依據(jù)，也為產(chǎn)前診斷開(kāi)辟了新途徑。

1.2cffDNA的來(lái)源與獲取 cffDNA是一段雙鏈且高度片段化的DNA片段，大多數(shù)分子長(zhǎng)度約為150 bp。雖然臨床研究證明孕婦外周血中存在cffDNA，但其來(lái)源目前尚不明確，推測(cè)有下列幾種可能：①來(lái)源于胎盤(pán)通道：游離的胎兒細(xì)胞通過(guò)胎盤(pán)通道滲透到母體血液當(dāng)中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，最終導(dǎo)致胎兒DNA殘留[1]；②來(lái)源于凋亡的胎兒細(xì)胞：胎兒細(xì)胞凋亡后降解、釋放出來(lái)的DNA通過(guò)直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到母體外周血中[5]，并且以兩種形式存在于母體血液循環(huán)中，一種是以完整細(xì)胞的形式存在，另一種則是以cffDNA的形式存在；③來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞：胎盤(pán)是連接胎兒與母體的直接通道，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的釋放與脫落是孕婦外周血中cffDNA出現(xiàn)的主要原因，其含量與孕周有關(guān)，并在分娩后2 h即從母體中消失。cffDNA的檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)使得無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷得到了進(jìn)一步的發(fā)展，但在臨床運(yùn)用過(guò)程中仍面臨很大的挑戰(zhàn)，主要原因是cffDNA與母體DNA存在50%的共有序列[6]，而且母體外周血中的胎兒細(xì)胞包括滋養(yǎng)層細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、造血干細(xì)胞和胎兒有核紅細(xì)胞等大量細(xì)胞，同時(shí)還存在嵌合細(xì)胞，使得滋養(yǎng)層細(xì)胞的含量很少，只有1%左右的滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)源于母體[7]。在妊娠階段，cffDNA占母體血漿中總循環(huán)游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)的3%～13%[8]，若孕周小于12周時(shí)，cffDNA在孕婦外周血中的含量則較低，常低于4%，可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)或者出現(xiàn)假陰性[9]。因此，提高胎兒DNA在孕婦外周血中所占比例是評(píng)估無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(non-invasive prenatal testing， NIPT)檢測(cè)準(zhǔn)確性的重要參數(shù)。Jorgez和Bischoff[10]通過(guò)DNA分子長(zhǎng)度分級(jí)分離法和全基因組擴(kuò)增法來(lái)提高cffDNA的富集效率，進(jìn)而降低母體cfDNA比例來(lái)提高NIPT檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 cffDNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用與發(fā)展

NIPT主要通過(guò)對(duì)孕婦血漿中的cffDNA進(jìn)行測(cè)序來(lái)鑒定胎兒非整倍體疾病[11]，主要通過(guò)采集孕婦外周靜脈血，利用新一代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)孕婦外周血漿中的cfDNA片段進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而確定DNA片段及其染色體，再通過(guò)計(jì)算每一條目標(biāo)染色體的片段數(shù)目，確定其是否較預(yù)期的cfDNA數(shù)量增加或減少，進(jìn)而計(jì)算染色體序列數(shù)目比率，從而檢測(cè)胎兒是否患有唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征等染色體異常疾病[12]。

在cffDNA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷之前，妊娠早期主要通過(guò)血清生化標(biāo)志物和產(chǎn)前超聲標(biāo)記聯(lián)合檢測(cè)胎兒非整倍染色體疾病。血清生化標(biāo)志物篩查原理是胎兒染色體如果發(fā)生異常可影響胎盤(pán)功能，從而導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)胎盤(pán)分泌的相應(yīng)血清生化指標(biāo)異常。Christiansen等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠第9～13周，與妊娠相關(guān)的血漿蛋白A水平下降、人絨毛膜促性腺激素β亞單位(human chorionic gonadotropin beta subunit, β-HCG)水平增高的孕婦存在唐氏綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。雖然通過(guò)血漿蛋白A、游離β-HCG和胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency， NT)的聯(lián)合篩查可診斷約90%的唐氏綜合征胎兒，假陽(yáng)性率約5%[13]，并且對(duì)愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征也有一定的篩查作用，但是該方法靈敏度有限，且無(wú)法對(duì)胎兒進(jìn)行遺傳疾病檢測(cè)。

2.1在染色體非整倍體疾病方面的應(yīng)用 1997年Lo等[1]在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)男性胎兒Y染色體特異性DNA片段，為cffDNA用于胎兒染色體非整倍體疾病的篩查提供了可能。1999年Lo等[14]通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)出cffDNA的異常增高與胎兒唐氏綜合征有關(guān)，進(jìn)而提出是否可以利用cffDNA水平變化作為產(chǎn)前檢測(cè)唐氏綜合征的標(biāo)志物。有學(xué)者運(yùn)用這一特性通過(guò)多重定量PCR技術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行染色體非整倍體疾病的相關(guān)檢測(cè)[15]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及新一代高通量基因測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)NIPT可以通過(guò)對(duì)cffDNA進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)胎兒染色體非整倍體疾病進(jìn)行篩查，并且cffDNA檢測(cè)能更早發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常，較傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法具有更高的的靈敏度和特異度[16]。

目前NIPT主要篩查高危孕婦的染色體非整倍體異常，對(duì)唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征這三大染色體疾病具有十分重要的意義，尤其是唐氏綜合征的檢出率可高達(dá)99%，假陽(yáng)性率僅為0.13%[17]。

2.2在染色體微缺失疾病方面的應(yīng)用 目前cffDNA已廣泛應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，并不斷發(fā)展形成了NIPT升級(jí)版(NIPT-plus)，該技術(shù)是在NIPT常規(guī)應(yīng)用cffDNA檢測(cè)13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)等染色體非整倍體疾病的基礎(chǔ)上，以全基因平行測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，主要用于5號(hào)、9號(hào)、16號(hào)染色體及性染色體異常等相關(guān)疾病的檢測(cè)和篩查，同時(shí)還可檢測(cè)15q11-q13、5p15.2-15.3、22q11.2、1p36及4p16.3等常見(jiàn)的染色體微缺失疾病[18]，而這種染色體缺失通過(guò)常規(guī)染色體檢測(cè)方法不易檢測(cè)，NIPT-plus技術(shù)的發(fā)展為其提供了可能。

2.3在基因遺傳性疾病方面的應(yīng)用 近年cffDNA逐漸應(yīng)用于基因遺傳性疾病的檢測(cè)，通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)，分析父母親基因組的單倍型并鑒定致病基因位點(diǎn)周?chē)膯魏塑账岫鄳B(tài)性，再對(duì)母體外周血漿中cffDNA進(jìn)行測(cè)序和相對(duì)單倍型劑量分析，進(jìn)而推測(cè)胎兒的突變狀態(tài)。目前cffDNA已成功檢測(cè)如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良[19]、脊髓性肌萎縮[20]、β-地中海貧血[21]、先天性腎上腺皮質(zhì)增生[22]及楓糖尿病[23]等基因遺傳性疾病。

2.4在胎兒RhD血型檢測(cè)方面的應(yīng)用 若紅細(xì)胞缺乏D抗原，臨床稱(chēng)為Rh陰性，而具有D抗原時(shí)則稱(chēng)為Rh陽(yáng)性。若血型為Rh陰性的母親再次妊娠血型為Rh陽(yáng)性的胎兒時(shí)，妊娠期間可有少量胎兒血液進(jìn)入母體的血液循環(huán)，進(jìn)而產(chǎn)生大量IgG抗體，該抗體通過(guò)胎盤(pán)屏障引起胎兒溶血，導(dǎo)致新生兒溶血性疾病的發(fā)生[24]，出現(xiàn)黃疸、貧血、肝脾增大等嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，重者出生后即有嚴(yán)重貧血、胎兒水腫及心力衰竭等臨床表現(xiàn)。通過(guò)檢測(cè)cffDNA，在妊娠中晚期便可檢測(cè)出胎兒RhD血型，進(jìn)而利用孕婦外周血中cffDNA對(duì)胎兒進(jìn)行RhD基因分型，爭(zhēng)取對(duì)新生兒溶血性疾病的發(fā)生做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療。

2.5在女性相關(guān)癌癥方面的應(yīng)用 有文獻(xiàn)報(bào)道，幾乎所有的癌癥都有體細(xì)胞基因改變，而這種體細(xì)胞基因改變可以通過(guò)循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)反映出來(lái)，而ctDNA是來(lái)源于腫瘤患者血液中的無(wú)細(xì)胞DNA部分[25]。cfDNA的改變往往會(huì)導(dǎo)致NIPT的檢測(cè)結(jié)果與胎兒檢測(cè)結(jié)果不一致，當(dāng)出現(xiàn)NIPT與最終診斷結(jié)果不一致時(shí)，接診醫(yī)師要想到母體患有惡性腫瘤的可能，此時(shí)母體外周血中cfDNA更多的是來(lái)源于母體癌細(xì)胞，而不是胎兒細(xì)胞。

Ji等[26]通過(guò)研究證明了運(yùn)用cffDNA檢測(cè)惡性腫瘤的可能，使得NIPT在拷貝數(shù)變異(copy number variations， CNVs)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，并且CNVs在ctDNA中的表征可作為腫瘤生物標(biāo)志物。因此，利用NIPT可以推測(cè)女性癌癥的預(yù)后和復(fù)發(fā)情況。低覆蓋率全基因組測(cè)序的NIPT平臺(tái)能夠有效識(shí)別早期和晚期女性癌癥，并能預(yù)測(cè)預(yù)后，尤其是在女性卵巢癌、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌晚期階段中的預(yù)測(cè)效果更好[27]，為檢測(cè)孕婦相關(guān)癌癥提供了可能，也為術(shù)后癌癥的復(fù)發(fā)提供了理論依據(jù)。

2.6在多胎妊娠方面的應(yīng)用 隨著輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展，其在解決了女性不孕不育的同時(shí)也使多胎妊娠的發(fā)生率逐漸升高，其中雙胎妊娠最常見(jiàn)。與單胎妊娠相比，多胎妊娠的相關(guān)妊娠疾病發(fā)病率增加，常規(guī)的產(chǎn)前篩查對(duì)于雙胎妊娠的檢測(cè)準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單胎妊娠，而侵入性產(chǎn)前檢查又會(huì)使流產(chǎn)和感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，cffDNA檢測(cè)能在避免侵入性操作的同時(shí)對(duì)雙胎妊娠進(jìn)行有效的產(chǎn)前篩查[28]。有研究表明雙胎非整倍體陽(yáng)性發(fā)生率為1.9%～8.1%[29]。Yu等[30]發(fā)現(xiàn)NIPT對(duì)于雙胎妊娠產(chǎn)前篩查的準(zhǔn)確性和特異度高達(dá)100%，更加證實(shí)了cffDNA可有效應(yīng)用于多胎妊娠的產(chǎn)前篩查。

3 cffDNA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中的優(yōu)勢(shì)與局限性

3.1cffDNA在產(chǎn)前診斷中的優(yōu)勢(shì) 傳統(tǒng)的有創(chuàng)性產(chǎn)前檢查方法主要通過(guò)侵入性操作對(duì)胎兒進(jìn)行染色體等相關(guān)疾病的檢測(cè)，如胎兒臍帶血取樣、羊膜穿刺和絨毛膜絨毛取樣等[31]。然而，侵入性產(chǎn)前檢查使流產(chǎn)發(fā)生率升高，早產(chǎn)和胎膜早破等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加[6]。NIPT通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血中cffDNA，有效避免了有創(chuàng)性檢查對(duì)孕婦及胎兒所造成的侵入性損害，使孕婦流產(chǎn)和感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，而且操作更加簡(jiǎn)便，安全性也相對(duì)較高，更易被孕婦所接受。

NIPT作為一種產(chǎn)前篩查方法，能夠有效檢測(cè)出染色體非整倍體疾病，對(duì)于胎兒染色體疾病的篩查和預(yù)防有著非常重要的作用，同時(shí)cffDNA與母體血清生化標(biāo)志物篩查相比，具有準(zhǔn)確率更高、假陽(yáng)性率更低的特點(diǎn)，尤其是對(duì)于唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征這三大染色體疾病的篩查具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。Taylor-Phillips等[32]研究表明NIPT在運(yùn)用孕婦外周血中cffDNA檢測(cè)胎兒染色體非整倍體疾病方面準(zhǔn)確性高，其中唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征的診斷準(zhǔn)確率分別高達(dá)99.3%、97.4%和97.4%。

3.2cffDNA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的局限性 孕婦外周血中cffDNA對(duì)于染色體非整倍體疾病的檢測(cè)主要受到以下因素的影響：①cffDNA在孕婦外周血中含量較少，尤其是孕周小于12周時(shí)，cffDNA在孕婦外周血中的含量常低于4%，可能出現(xiàn)cffDNA無(wú)法檢測(cè)或者出現(xiàn)假陰性[12]，這也是NIPT多在妊娠12～26+6周進(jìn)行的原因[33]；②cffDNA來(lái)源于胎盤(pán)DNA，而非胚胎本身DNA，同時(shí)與母體DNA存在50%的共有序列[9]，故部分假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)也是不可避免；③目前cffDNA主要應(yīng)用于唐氏綜合征、愛(ài)德華綜合征和帕托綜合征等染色體非整倍體疾病的篩查，準(zhǔn)確性較高，但是篩查的染色體范圍有一定局限性，且當(dāng)孕婦出現(xiàn)多胎、嵌合體及父母親中存在染色體異常等情況時(shí)則不適于采用cffDNA進(jìn)行產(chǎn)前篩查。

雖然孕婦外周血中cffDNA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用存在一定的局限性，但是其作為一種產(chǎn)前篩查方法能夠有效檢測(cè)出染色體非整倍體疾病，對(duì)于胎兒染色體疾病的篩查和預(yù)防有著非常重要的作用，且在保證靈敏度和特異度的同時(shí)也能降低流產(chǎn)和感染的發(fā)生率，是一種無(wú)創(chuàng)、早期、安全的產(chǎn)前篩查方法，易被孕婦所接受，可廣泛應(yīng)用于臨床產(chǎn)前檢測(cè)。