彤麗格, 羅會穎, 孟昆

中國農業(yè)科學院飼料研究所, 農業(yè)農村部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081

糖類是自然界中廣泛分布的一類重要有機化合物。它既是生物體的結構成分，也是所有消費者的主要能量物質。因此，糖類在自然界物質和能量的循環(huán)利用中扮演著十分重要的角色。糖類物質根據聚合度可分為單糖、寡糖和多糖[1]。寡糖氧化酶是一類能夠將寡糖和一些單糖氧化為相應的內脂產物，內酯產物進一步生成相應的醛酸同時釋放過氧化氫的酶[2]。這些酶因展現出來的作為診斷試劑、工業(yè)生物催化劑、食品和飼料添加劑的潛在能力而受到了極大的關注[3]。

BRENDA酶數據庫(https://www.brenda-enzymes.org)所包含的酶類，大多數都是對多種單糖和二糖具有特異性的酶，少數類別表現出對低聚糖具有高活性，這其中就包括葡糖寡糖氧化酶(gluco-oligosaccharide oxidase，GOOX)、木寡糖氧化酶(xylo-oligosaccharide oxidase，XOOX)、殼寡糖氧化酶(chito-oligosaccharide oxidase，COOX)和乳糖氧化酶(lactose oxidase，LAOX)等。2013年，碳水化合物活性酶數據庫(CAZy，http://www.cazy.org)中增加了1個新分類：具有輔助活性的碳水化合物活性酶(auxiliary activity family，AA家族)，并將目前研究較少的寡糖氧化酶歸類為AA7家族。目前，CAZy數據庫中共有167條序列屬于AA7家族，全部來源于真核生物。其中，明確注明為寡糖氧化酶的序列為5條，有性質研究和晶體結構報道的寡糖氧化酶為4個。

寡糖氧化酶屬于香草基乙醇氧化酶(vanillyl alcohol oxidase，VAO)黃素蛋白家族[4]，具有開放的碳水化合物結合溝模塊，可容納多種長鏈寡糖，因而具有較為廣泛的底物譜，且對于寡糖的催化效果優(yōu)于單糖。與目前研究較為廣泛的葡萄糖氧化酶相比，兩類酶均會在與底物反應的過程中產生過氧化氫，但寡糖氧化酶活性受過氧化氫影響較小，這一特點使其不易在反應過程中失活，所以寡糖氧化酶具有較強的研究與應用價值。然而，寡糖氧化酶在異源宿主(如大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等)中表達困難、性質和結構研究欠缺等問題極大地限制了其深入研究和廣泛應用。本文通過總結當前寡糖氧化酶的性質和結構等相關研究進展，以期為促進寡糖氧化酶的深入研究、推動其在產業(yè)上的應用提供參考。

1 寡糖氧化酶基本酶學性質

寡糖氧化酶中研究較多的是GOOX，其最早于1991年由Lin等[5]在從土壤中分離出的枝頂孢霉AcremoniumstrictumT1(后來更名為Sarocladiumstrictum)中獲得。來源于SarocladiumstrictumGOOX-T1的寡糖氧化酶反應溫度在37～50 ℃之間，最適溫度為50 ℃，且在50 ℃下處理1 h仍保持穩(wěn)定；其最適pH為10.0，且在pH 5.0～11.0的范圍內穩(wěn)定[6-7]。來源于嗜熱毀絲霉MyceliophthorathermophilaC1的XOOX，其作用的最適溫度為30 ℃，在60 ℃時仍能保持50%的酶活力；其最適pH為7.0，與GOOX-T1類似[3]。Xu等[8]報道了一個來源于雪霉微座孢Microdochiumnivale的碳水化合物氧化酶，其因在診斷試劑和工業(yè)催化劑中具有重要的應用價值而受到關注。該酶作用的最適溫度為23 ℃，最適pH為5.5，能夠催化多種寡糖、單糖及聚糖發(fā)生氧化反應[9-11]。綜合來看，目前已報道的碳水化合物氧化酶的最適溫度和最適pH并不接近，報道較多的最適溫度在38 ℃左右[11]，最適pH則顯示在2個范圍內，分別為pH 6.0～6.5和pH 9.0～10.5[7,12]。

寡糖氧化酶具有較為廣泛的底物譜。XOOX對多種底物均具有催化活性，其中對于木寡糖的催化活性最高，其次是纖維二糖和乳糖[3]。來源于禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum的COOX是目前已報道的唯一能夠氧化N-乙酰碳水化合物的氧化酶類[13-14]。而GOOX的底物譜更為寬泛，既可以氧化葡萄糖、麥芽糖、乳糖和纖維寡糖[6,15]，也可以氧化木寡糖和木聚糖[16-17]。研究表明，還原末端由α鍵或β-1,4糖苷鍵連接葡萄糖殘基的二糖均可作為GOOX的良好底物，而含有其他鍵型的二糖則不是；GOOX的活性對葡萄糖低聚物底物具有優(yōu)先性，唯一的單糖底物是D-葡萄糖；GOOX還可以與具有至少6個葡萄糖基殘基的纖維低聚糖反應[15]。纖維二糖和乳糖與GOOX的結合能力比麥芽糖強，這是糖苷鍵的立體化學構造不同造成的，α鍵或β-1,4糖苷鍵使得這2種二糖在糖基結合中較麥芽糖表現出更好的結合能力。但同時也觀察到在纖維二糖和乳糖作為底物時存在較為嚴重的底物抑制現象[15]。

2 寡糖氧化酶結構和催化機制

2.1 分子結構

目前已經獲得晶體結構的寡糖氧化酶有來源于A.strictum的GOOX(2AXR)[18]和來源于M.thermophilaC1的XOOX(5K8E)，二者具有44%的序列一致性[3]。它們都有2個結構域：黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)結合結構域(F)和底物結合結構域(S)，其中，F結構域極為保守，而S結構域保守性較差。另外，這2種酶的晶體結構顯示它們均具有1個開放的碳水化合物結合溝，且其輔因子FAD也都是通過共價方式結合的。

來自A.strictum的GOOX，其F結構域折疊成2個(α+β)區(qū)域，其中包括N-末端殘基1～206位和C-末端殘基421～474位。如圖1所示，右上方的區(qū)域中心包含4個相連的β折疊片(β1～β4)，其中β1與其他鏈反向平行，折疊片外圍由3個螺旋(αA、αA’和αB)構成，αA螺旋的Cys6和αB螺旋的Cys55之間存在1個二硫鍵。左上側的區(qū)域包含5個反平行β折疊片(β5～β9)，并被5個α螺旋(αC、αD、αD’、αJ和αK)包圍。這2個區(qū)域相互作用并將輔因子FAD包裹在其中，且β9 N末端195位的酪氨酸的主鏈與腺嘌呤N1和N6之間的氫鍵十分保守[19]。GOOX的S結構域是由7個反向平行β鏈(β10～β16)組成，兩側為5個α螺旋(αE～αI)。該結構域位于FAD輔因子的異咯嗪環(huán)附近，也是構成碳水化合物結合溝的重要部分[17-18]。

圖1 GOOX立體結構視圖[18]

M.thermophilaC1來源的XOOX的F結構域包含殘基25～231位和447～497位， S結構域包含殘基232～446位。如圖2所示，F結構域含有2個亞結構域。第1個亞結構域由3條平行的β鏈組成，一側由2個α-螺旋組成，另一側由1個α-螺旋組成。第2個較大的亞結構域則含有5個反向平行的β-鏈，被6個α-螺旋包圍。FAD結合口袋嵌在2個子域之間。在第1個亞結構域中的第1個和第3個α-螺旋之間存在1個保守的二硫鍵(Cys30-Cys79)，猜測其可能具有穩(wěn)定N-末端的螺旋結構的功能[3]。

盡管XOOX的整體結構類似于GOOX，但在研究中發(fā)現XOOX底物結合溝內存在3個獨特的殘基：Tyr376、Leu274和Ile378。研究人員認為這些殘基可能在防止己醛糖與XOOX的結合過程中發(fā)揮作用[3]。對GOOX和COOX的深入研究表明，這些氧化酶可作用于多種單糖和寡糖，其中對低聚糖最為有效。寡糖氧化酶中的開放活性位點結構不同于優(yōu)先與單糖作用的碳水化合物氧化酶。如葡萄糖氧化酶和吡喃糖氧化酶的活性位點都較為封閉[20-21]，而寡糖氧化酶具有開放的碳水化合物結合溝且是在靠近表面的位置[22]。另外，形成碳水化合物結合溝的部分氨基酸殘基決定了其底物特異性，如通過替換3個殘基，就可使COOX產生有效的乳糖氧化酶活性[13]。

注：綠色區(qū)域為F結構域，紅色區(qū)域為S結構域，黃色區(qū)域為黃素輔因子FAD。

2.2 催化機制

研究表明碳水化合物氧化酶[8,23]催化機理符合乒乓催化機制[14]，碳水化合物氧化酶通過與醛官能團反應來催化葡萄糖和其他單糖、寡糖的氧化，反應的過程中伴隨著過氧化氫的產生。雖然GOOX與大多數存在FAD依賴的氧化酶和脫氫酶[22]的催化反應類似，但GOOX的反應是由還原反應和氧化反應組成的。其中，還原反應則是在寡糖氧化酶的催化下，通過氫原子轉移到N5原子將β-d-葡萄糖游離的還原端殘基氧化生成葡萄糖酮-1,5-內酯，內酯產物自發(fā)水解為相應的糖酸類物質。在氧化反應中，氧分子與已氧化的FAD反應產生過氧化氫。已有的對于GOOX中的一些可能起催化作用的氨基酸的功能研究表明，某些氨基酸之間存在由水介導的氫鍵，可以通過降低其他氨基酸的pKa值來協(xié)助質子轉移；Gln38和還原端OH1基團之間的相互作用表明Gln38可能有助于酶與底物接觸并促進Tyr429的質子提取能力；His138、Tyr426和Tyr144的主鏈可能參與還原黃素的陰離子形式的穩(wěn)定化。此外，在碳水化合物結合溝上方并朝向黃素部分的一個大的充滿水的通道可以作為第二底物分子氧的入口點[18]。

圖3 GOOX催化機制示意圖[18]

3 寡糖氧化酶的分子改良

天然寡糖氧化酶的催化性能和性質等較差，無法滿足工業(yè)生產的需求。通過理性設計及定向進化的方法對寡糖氧化酶進行分子改良，可有效改善其性能。但目前此類酶的相關研究較少，主要是圍繞特定位點開展了一些研究。

3.1 定點突變

目前已報道的分子改良研究表明，通過定點突變的手段大多可以實現影響酶與底物親和力的效果。研究人員將來自F.graminearum的COOX中的Q286位點突變?yōu)镽后，其以纖維寡糖、麥芽糖、葡萄糖和乳糖作為底物時，Km值降低，而以N-乙酰葡萄糖胺和殼寡糖作為底物則表現出Km值的增高，但對所有底物的Kcat值并沒有明顯的變化。所以該位點的突變主要影響了酶與底物的親和力[14]。2015年，Ferrari等[13]通過G270E/S410R 2個位點的組合突變，得到了對N-乙酰葡萄糖胺具有最高的催化效率的COOX突變體。

通過對來源于A.strictum的GOOX進行定點誘變或突變，同樣可使其對單糖和寡糖底物的親和力有所改變。研究人員選擇Y300和W351這2個位于-2位葡糖基結合亞位點進行定點突變，構建了Y300A、Y300N和W351F 3個突變體，其中，Y300A和Y300N顯示出對所有測試的單糖和寡糖的Kcat值大約提高了1倍，同時Km值也有所增加；突變體W351F也增加了對寡聚底物的Km值，但突變體W351F對于所有底物的催化活性都略微降低，這是由于-2位葡糖基結合亞位點之間的疏水相互作用力的降低增加了寡糖的Km和Kd值，降低了總催化效率。這些結果表明Y300這個位點促進了與含有2個以上單元的底物的疊加相互作用[6]。

3.2 結構域融合

碳水化合物結合結構域(carbohydrate-binding module，CBM)被融合到各種水解酶中，以提高水解酶對于可溶性和不溶性聚合物底物的催化活性[24-26]。除了可以促進酶的再循環(huán)與簡化下游加工步驟，CBM與酶的融合也能夠促進蛋白質純化過程。此外，由于CBMs的結合親和力較強，已被廣泛用于酶的固定化[27-28]。

將來自CBM22家族的木聚糖結合模塊融合到GOOX的N末端，可以增強酶對木聚糖表面的功能性固定能力[17]。Foumani等[6]的研究表明，來自S.strictum的GOOX-VN可以有效地氧化葡萄糖和低聚木糖。為了改善GOOX-VN對聚合物底物的活性，將來自熱纖梭菌的3個碳水化合物結合模塊Ct CBM3、Ct CBM11和Ct CBM44分別融合到GOOX-VN的N末端與C末端，構成了6種融合蛋白。除GOOX-Ct CBM3和GOOX-Ct CBM44 2個融合體外，其余CBM的融合體均使得酶的Kcat值增加，并使其對纖維四糖的催化活性提高了50%。CBM融合體選擇性地增強了GOOX與可溶性和不溶性多糖的結合能力，并且固定在固體纖維素表面上的酶也同樣可以保持穩(wěn)定性和活性。此外，CBM的融合使來自S.strictum的GOOX-VN對可溶性葡甘露聚糖的活性提高了30%，對不溶性結晶和無定形纖維素的活性也提高了50%以上[17,25]。

4 寡糖氧化酶的應用

碳水化合物氧化酶類廣泛存在于自然界中，并主要來源于真菌。因其相對穩(wěn)定，不需要昂貴的輔酶，所以被廣泛用于醫(yī)療診斷、食品和飲料加工以及碳水化合物合成等方面。如碳水化合物氧化酶類可用于生物傳感器以及血液中的葡萄糖檢測試劑的研發(fā)[29]；其也可催化乳糖生物轉化為增值產品乳糖酸[11]；其還可以作為面團或面包的改良劑[30-33]。此外，碳水化合物氧化酶類可在液體洗滌劑中用于生產漂白劑[33]，還能作為氧清除劑[34]。

4.1 葡糖寡糖氧化酶的應用

寡糖氧化酶和葡萄糖氧化酶反應終產物類似，在以葡萄糖為底物時，寡糖氧化酶的反應終產物也是糖酸類物質，并產生過氧化氫。寡糖氧化酶作用底物寬泛，在飼料、食品、醫(yī)學領域以及生物傳感器方面都具有較好的發(fā)展前景。

在飼料領域，GOOX可以在動物腸道中優(yōu)先氧化除葡萄糖以外的寡糖，而葡萄糖依舊可為生物體供能；由于在與底物反應的過程中會釋放出大量的過氧化氫，GOOX還可以在動物胃腸道中營造偏酸性的環(huán)境，有利于益生菌生長。也是基于這一特點，在食品領域，GOOX可以去除低度酒精飲品中的多余糖分，防止后期自然發(fā)酵，進而影響飲品的口感；并抑制發(fā)酵液中微生物的生長，達到減少使用其他化學防腐劑并提高產品貨架期的效果。此外，GOOX可通過催化葡萄糖最終形成葡萄糖酸，葡萄糖酸可以作為酸味劑改善食品的風味，如添加到低脂牛奶中可以改善苦澀的口感，同時也是一種潛在的酸性抗氧化劑。

目前，葡萄糖生物傳感器占世界生物傳感器市場的約85%[35]，而多糖(如甲殼質、殼聚糖等)也因優(yōu)越的生物相容性和成膜能力而被廣泛應用于電化學生物傳感器方面[36]?；贕OOX的傳感器也具有廣泛的底物譜，可用于檢測生物精煉和食品工業(yè)中產生的各種低聚糖，如纖維素、木糖、麥芽低聚糖和乳糖。

4.2 木寡糖氧化酶的應用

由于XOOX的底物范圍較窄，可以發(fā)展成為有價值的生物催化劑。如XOOX可用于木聚糖酶活性測定[37]。XOOX還可將羧基部分引入低聚木糖，從而產生醛糖酸，而醛糖酸是一種較具應用價值的化合物[38]。

在植物總生物量中，半纖維素是僅次于纖維素的第二大類多糖物質。在所有半纖維素成分中木聚糖含量最高。通過化學或生物(酶)處理半纖維素的木聚糖成分可以產生木寡糖[39]。一方面木寡糖目前常被用于膳食纖維和益生元[40]，另一方面木寡糖也被用作木聚糖酶和纖維素酶抑制劑[41-43]。為了高效降解或修飾木寡糖，達到有效降解植物生物質的目的，基于XOOX對木寡糖的高度特異性的底物接受特性，XOOX可以在減輕生物量轉化過程中承擔起抑制木寡糖的作用，從而消除木寡糖對纖維素酶的抑制作用。除了在降解或修飾水解的木聚糖中起作用，氧化酶類還可以用作產生過氧化氫的生物催化劑。然而，目前XOOX的作用在真菌中并不普遍，且基因組序列數據庫中與其具有較高同源性的序列也較少。顯然，仍需要進一步的研究來闡明XOOX的確切用途，以揭示XOOX作為生物催化劑的真正應用能力。

5 展望

目前，寡糖氧化酶尚未投入市場，所面臨的挑戰(zhàn)首先是當前研究報道的寡糖氧化酶基因較少。在后續(xù)研究中，挖掘相關基因時應多考慮環(huán)境因素，如極端的溫度或pH環(huán)境，或選擇特殊的工農業(yè)生產環(huán)境及產物；對已公開的未報道功能的寡糖氧化酶序列可嘗試通過預測結構進行篩選，或建立高效的高通量篩選方法。其次，與應用較為廣泛的葡萄糖氧化酶相比，寡糖氧化酶催化活性并不高，且寡糖氧化酶在異源宿主中很難實現高效表達，已在酵母中成功表達的GOOX則需要在低溫、高轉速的培養(yǎng)條件下進行誘導發(fā)酵[4]。大部分的寡糖氧化酶均來源于真菌，所以在大腸桿菌中表達可能不能達到預期效果。鑒于氧化酶類普遍存在異源表達不易的情況，可以考慮通過微氧培養(yǎng)的方法，或可以通過優(yōu)化密碼子等手段使其適應通用載體并提高表達量。

雖然目前對于COOX和LAOX應用的研究尚無具體報道，但根據二者的特性，后續(xù)可利用COOX氧化殼寡糖類物質，從而生產氨基葡萄糖、制造軟骨素等；LAOX則可以用于生產乳糖酸。寡糖氧化酶是一類黃素酶，在多種工業(yè)生物催化應用領域具有應用價值。因此，寡糖氧化酶的研究方向應從2個方面入手：一方面是不斷挖掘新酶；另一方面對現有的寡糖氧化酶進行結構、功能及分子改良方面的研究，從而促進其在工業(yè)中的應用。