劉曉, 朱鵬宇, 景小艷, 李志紅, 張永江, 李想, 付偉,*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 北京 100193；

2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176；

3.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200433

轉(zhuǎn)基因作物自1994年商業(yè)化以來種植面積逐年增加，2017年達到了1.898億 hm2。雖然各國對轉(zhuǎn)基因作物的安全性評價標(biāo)準(zhǔn)有所不同，轉(zhuǎn)基因作物的種植國家與種植面積在近些年來也略有變動，但總體發(fā)展態(tài)勢十分良好。其中轉(zhuǎn)基因大豆是研究比較多并且最早商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物品種，種植面積達到了9 140萬hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總量的50%[1]。由于國內(nèi)大豆生產(chǎn)成本高、進口大豆質(zhì)優(yōu)價低等因素，同時國內(nèi)大豆市場面臨國內(nèi)種植規(guī)模小但需求量高的矛盾，我國需要進口大豆保障市場需求。國際市場上的大豆產(chǎn)品種類繁雜，其中轉(zhuǎn)基因大豆占有相當(dāng)大的比重。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的公告，截至2019年1月共有14個大豆轉(zhuǎn)基因品系獲得我國轉(zhuǎn)基因生物進口安全證書(表1)，這些轉(zhuǎn)基因大豆品系隨著國際貿(mào)易作為食品加工原料進入我國市場。除已獲批的14個轉(zhuǎn)基因大豆品系外，幾個主要進口國還大面積種植了其他轉(zhuǎn)基因品系，這些未獲準(zhǔn)入的大豆有可能在生產(chǎn)加工、運輸、銷售等過程中摻入其中，給我國進口大豆的精準(zhǔn)檢測帶來障礙。同時為了滿足眾多消費者的知情權(quán)和消費權(quán)，必須加強轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)管，提升轉(zhuǎn)基因大豆的精準(zhǔn)檢測技術(shù)。實現(xiàn)這一目的的基礎(chǔ)就是要加快實現(xiàn)微量轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測，完善轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理體系。

目前，轉(zhuǎn)基因成分定量檢測應(yīng)用最多的是實時熒光PCR技術(shù)[2]，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度曲線，檢測閾值來計算轉(zhuǎn)基因成分含量，但是在實際應(yīng)用中有一定局限性，其中最主要的是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：首先很難做到精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度，其次在操作步驟及繪制曲線過程中會產(chǎn)生人工誤差，數(shù)字PCR能夠避免這些問題并且不受擴增效率的影響[4-5]。在實際檢測過程中，不僅要檢測大豆原料，有時也需要檢測大豆深加工產(chǎn)品。深加工產(chǎn)品含有添加劑、色素等成分，往往提取的DNA質(zhì)量不高，亟需選擇一種靈敏度更高的檢測方法，因此有學(xué)者嘗試使用數(shù)字PCR檢測方法，并證實了數(shù)字PCR靈敏度及重復(fù)性高于其他PCR方法[6-8]。dPCR是一種基于油包水結(jié)構(gòu)實現(xiàn)單分子擴增的PCR方法，能實現(xiàn)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測拷貝數(shù)，利用內(nèi)參基因與外源基因拷貝數(shù)比例來計算轉(zhuǎn)基因成分含量，從而實現(xiàn)高靈敏度的定量并廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測。吳瀟等[9]利用微滴式數(shù)字PCR成功建立了轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系的檢測方法。周圓等[10]建立了3種轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式數(shù)字PCR檢測方法。Corbisier等[11]利用數(shù)字PCR方法也成功地檢測到了轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系，并驗證了其與實時熒光PCR結(jié)果的一致性。

對于轉(zhuǎn)基因成分的絕對定量檢測來說，單重檢測在單個基因準(zhǔn)確性方面具有較好的擴增效果，而且檢測的穩(wěn)定性較高；但是由于轉(zhuǎn)基因成分絕對定量是基于外源基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的比值，因此雙重檢測具有潛在的較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，而且相較于單重檢測來說，具有較低的成本。

表1 轉(zhuǎn)基因大豆安全證書(進口)批準(zhǔn)清單

本研究基于數(shù)字PCR方法，針對MON87705、MON87769和DP356043三種轉(zhuǎn)基因大豆的品系特異性序列進行引物的設(shè)計與優(yōu)化，驗證雙重數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因大豆中的特異性、重復(fù)性、檢測限和在實際樣品中的檢測效果等參數(shù)，并對雙重微滴式數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因大豆檢測的可行性以及標(biāo)準(zhǔn)化進行初步分析。在已有研究中，3個大豆品系的定量檢測方法較少，其中轉(zhuǎn)基因大豆MON87705尚未通過我國進口審批，但已在國外商業(yè)化，實際檢測依靠篩選元件的篩查與判斷不夠準(zhǔn)確，而本研究獲得了3種大豆品系特異性序列，并針對側(cè)翼片段和間插序列設(shè)計了引物與探針，以期能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分的品系溯源，為轉(zhuǎn)基因大豆或大豆制品轉(zhuǎn)基因成分定量研究提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆100% MON87705、100% MON87769、10% DP356043、MON87705、標(biāo)準(zhǔn)品購自美國油脂化學(xué)家協(xié)會(American Oil Chemists’ Society, AOCS)。ddPCR 預(yù)混液、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽膠墊和96孔板購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗儀器

Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量儀(Thermo Scientific, 美國)；QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國, 包括微滴生成儀、微滴讀取儀和封膜儀)；ABI StepOne Plus定量PCR儀(Applied Biosystem，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1DNA提取 轉(zhuǎn)基因大豆基因組采用改良CTAB法提取，基因組DNA通過Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量儀檢測純度和濃度。

1.3.2引物與探針設(shè)計 大豆單拷貝內(nèi)參基因lectin采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN1204-2016提供的引物探針序列，大豆品系特異性區(qū)域序列參考GenBank并測序驗證，采用NCBI數(shù)據(jù)庫引物設(shè)計工具進行引物和探針的設(shè)計，并由英濰捷基(上海)股份有限公司合成，引物及探針信息見表2。

表2 引物探針序列

1.3.3微滴數(shù)字PCR 微滴式數(shù)字PCR包含四步：PCR體系配置、微滴生成、PCR擴增和信號讀取。數(shù)字PCR體系為(20 μL)：10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol·L-1內(nèi)參基因，外源基因的正向引物和反向引物各1 μL，雙探針各0.5 μL，DNA模板1 μL(模板濃度50 ng·μL-1)。微滴生成步驟需要專用的微滴生成卡以及微滴生成儀，將20 μL PCR體系和70 μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴。將微滴轉(zhuǎn)入96孔板，用錫箔紙密封置于ABI-PCR儀中進行擴增。以lectin為內(nèi)參基因，實驗設(shè)置空白對照，并且每個樣品3個平行。

微滴數(shù)字PCR擴增程序：94 ℃，10 min預(yù)變性；94 ℃變性15 s，57 ℃退火60 s，39個循環(huán);98 ℃熱失活10 min。擴增階段結(jié)束將96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，并使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3.4外源拷貝數(shù)的計算 ddPCR采用直接計數(shù)的方法進行拷貝數(shù)的計算。通過數(shù)字PCR反應(yīng)總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)直接計算得到同一待測樣中外源基因與內(nèi)參基因的絕對拷貝數(shù)，再計算轉(zhuǎn)基因樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量即可。轉(zhuǎn)基因成分含量計算公式如下所示：

轉(zhuǎn)基因成分含量=(外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù))×100%

1.4 特異性檢測

實驗以3個轉(zhuǎn)基因大豆品系：MON87705、MON87769、DP356043為實驗材料，并加入了轉(zhuǎn)基因大豆常見品系DAS44406、MON87701驗證不同品系雙重數(shù)字PCR方法的特異性。具體反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.3.3。

1.5 定量范圍檢測

將50 ng·μL-1的轉(zhuǎn)基因大豆基因組用水進行梯度稀釋，經(jīng)過濃度梯度稀釋后的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA用于雙重數(shù)字PCR定量范圍及檢測限的測定。具體反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

實驗所用的轉(zhuǎn)基因品系特異性測定實驗結(jié)果見圖1。實驗所用的品系特異性引物探針組合對非靶標(biāo)大豆品系無擴增，數(shù)字PCR結(jié)果陰性點與陽性點的熒光信號區(qū)分明顯，由圖1B可知所建立方法可同時分析外源基因與內(nèi)參基因的兩種熒光信號并且相互無交叉擴增的影響。

2.2 定量范圍檢測

定量范圍是指雙重數(shù)字PCR檢測方法所能實現(xiàn)穩(wěn)定定量檢測的質(zhì)量百分比范圍。滿足穩(wěn)定拷貝數(shù)：20 μL體系的數(shù)字PCR反應(yīng)孔包含的目的基因拷貝數(shù)。定量檢測應(yīng)實現(xiàn)界定線性范圍內(nèi)的點滿足線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性系數(shù)大于95%。對于轉(zhuǎn)基因成分檢測來說重點是低含量轉(zhuǎn)基因成分的有效檢出，因此本研究重點對雙重數(shù)字PCR檢測限進行了檢測。

A:轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性驗證結(jié)果；B:轉(zhuǎn)基因大豆MON87705品系雙重dPCR的二維散點圖 藍色點—外源基因陽性，綠色點—內(nèi)參基因陽性，橘色點—外源基因陽性和內(nèi)參基因陽性; C、D、E:分別為轉(zhuǎn)基因大豆品系MON87705、MON89788、DP356043外源基因的微滴dPCR結(jié)果 藍色點—陽性，灰色點—陰性，粉色線—熒光閾值限。

質(zhì)量百分比MON87705平均RSD/%質(zhì)量百分比MON87769平均RSD/%質(zhì)量百分比DP356043平均RSD/%100%7225.28100%75419.2010%16134.4050%41715.0250%37412.045%8717.4025%2357.6225%19914.672.5%4439.425%3418.875%2317.841.25%2305.320.5%4.924.000.5%1118.180.5%4023.330.05%1.40.05%3.70.05%2.5NTC0NTC0NTC0

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆定量檢測結(jié)果

通過三個品系的雙重數(shù)字PCR定量結(jié)果及雙重數(shù)字PCR反應(yīng)熱點圖可以看出，本研究中雙重數(shù)字PCR檢測體系具有較高的檢測線性，并且不同組內(nèi)的RSD值小于25%。雙重數(shù)字PCR反應(yīng)陽性點與陰性點的區(qū)分非常明顯，結(jié)果表明所建立方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。從驗證結(jié)果可以看出，本研究中的檢測體系在質(zhì)量百分比為0.5%的樣品中可以實現(xiàn)穩(wěn)定擴增，在0.05%的樣品中可以出現(xiàn)陽性結(jié)果，但是所有平行不全為陽性，因此，本研究設(shè)定定性檢測限定為0.05%，定量檢測限為0.5%。

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆品系拷貝數(shù)分析

利用轉(zhuǎn)基因成分含量計算公式進行計算，結(jié)果如表4所示，MON87705和MON87769含量分別為115.43%、104.08%，DP356043含量為12.75%，RSD均符合穩(wěn)定定量檢測標(biāo)準(zhǔn)。

表4 大豆轉(zhuǎn)基因成分拷貝數(shù)結(jié)果

3 討論

近年來隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣及商業(yè)化程度的加深，進口產(chǎn)品或市售大豆制品所含轉(zhuǎn)基因成分越來越復(fù)雜，實際檢測過程中常常會遇到樣品混雜、純度低或多拷貝整合等情況[12]，十分不利于國家對轉(zhuǎn)基因商品市場的監(jiān)督管理。數(shù)字PCR方法作為一種新型的準(zhǔn)確定量技術(shù)，在靈敏度、穩(wěn)定性等方面都優(yōu)于其他PCR方法，更適合應(yīng)用于實際檢測工作。本研究建立了一種轉(zhuǎn)基因大豆品系的數(shù)字PCR檢測方法，驗證了檢測特異性、定量范圍等參數(shù)，結(jié)果顯示實驗所用引物探針組合在數(shù)字PCR方法中僅對目標(biāo)大豆品系有熒光信號產(chǎn)生，可以進行特異性擴增，用于大豆轉(zhuǎn)基因品系的篩選與鑒別，方法也可以準(zhǔn)確檢測出大豆中轉(zhuǎn)基因成分的含量，定量檢測限可達0.5%，研究同時測定了轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因拷貝數(shù)，其結(jié)果與購買標(biāo)準(zhǔn)品的參數(shù)大體一致，也說明本研究建立的雙重數(shù)字PCR體系能夠準(zhǔn)確且穩(wěn)定的滿足實際檢測需要。數(shù)字PCR是一種靈敏、準(zhǔn)確的定量技術(shù)，操作流程較為簡單，采用基因組DNA可直接進行檢測。此外不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以直接實現(xiàn)對拷貝數(shù)的絕對定量分析，在線性范圍、檢測極限和定量極限等方面都更勝于實時熒光PCR，因此受到很多學(xué)者的認(rèn)可[13-14]。雙重數(shù)字PCR相對于單重數(shù)字PCR在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性方面具有明顯的優(yōu)勢，尤其是檢測通量大大提高[15]。通過對實際樣品的檢測所建立的雙重數(shù)字PCR方法適用于港口及各檢驗檢疫單位或者其他科研單位，以進行轉(zhuǎn)基因大豆的品系特異性高效定量成分檢測。