李國華, 高錦偉, 周希勝, 王霞, 程偉華

1.陜西省延安市延安職業(yè)技術(shù)學院, 陜西 延安 716000;

2.陜西省延安市安塞區(qū)中醫(yī)醫(yī)院, 陜西 延安 717400;

3.陜西省寶雞市鳳翔縣醫(yī)院, 陜西 寶雞 721400;

4.陜西省寶雞市中心醫(yī)院肝膽胰脾外科, 陜西 寶雞 721000

T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制性基序結(jié)構(gòu)域[ T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) domain，TIGIT ]是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，是CD28家族的成員之一，TIGIT的基因位于人類第16號染色體，編碼由244個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白[1-2]。TIGIT的結(jié)構(gòu)包括胞外段的IgV結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)段的ITIM結(jié)構(gòu)域。TIGIT僅限于在淋巴細胞上表達，其中表達水平較高的為CD4+調(diào)節(jié)性T細胞、CD4+濾泡輔助性T細胞、CD8+效應(yīng)T細胞和自然殺傷(natural killer，NK)細胞，而在靜息和活化B細胞表面均未檢測到TIGIT的表達[3-5]。

近年來，TIGIT作為一種新型的免疫抑制性受體，在機體的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要角色，其對免疫細胞功能的影響也開始被重視。Yu等[6]的研究表明TIGIT可以作為配體作用于樹突狀細胞(dendritic cell，DC)表面的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(polivirus receptor，PVR/CD155)，并證明了TIGIT通過PVR通路可以誘導DC細胞提高IL-10的分泌水平從而抑制免疫反應(yīng)。Joller等[7]構(gòu)建了TIGIT基因敲除小鼠，在無抗原提呈細胞存在的培養(yǎng)體系中，利用具有功能活性的TIGIT單克隆抗體刺激T細胞，出現(xiàn)免疫應(yīng)答下調(diào)的現(xiàn)象，表明TIGIT可以直接抑制T細胞的增殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，TIGIT不但表達于T細胞表面，其在NK細胞表面也有高水平的表達，而且對NK細胞發(fā)揮直接抑制作用[8]。

為了進一步探究TIGIT對NK細胞的免疫負調(diào)節(jié)功能及機制，本研究利用分子生物學方法，將攜帶人TIGIT胞外段(即TIGIT第1～135位氨基酸，以保留功能結(jié)構(gòu)域IgV區(qū)，此胞外段簡稱為TIG)與人免疫球蛋白G3(immunoglobulin G3，IgG3)Fc段的基因融合，然后插入真核表達載體pcDNA3.1(-)中，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc。免疫球蛋白IgG3中的Fc段作為重要的蛋白融合標簽，不但可以延長小分子蛋白質(zhì)在體內(nèi)的代謝時間，還可以作為識別標簽用于目的蛋白的純化[9-11]。隨后通過檢測細胞增殖和IFN-γ的分泌水平來明確TIG-Fc融合蛋白對NK細胞功能的影響，以期為研究相關(guān)疾病的免疫機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人TIGIT全長基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；含有人IgG3 Fc段的質(zhì)粒由本實驗室保存；真核表達載體pcDNA3.1(-)購自美國Ambion公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；NK-92細胞購于美國ATCC公司；人胚腎細胞HEK-293T由本實驗室保存；抗人TIGIT [藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標記]抗體購自美國eBioscience公司。

胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國HyClone公司；限制性內(nèi)切酶(NheⅠ和NotⅠ)、T4 DNA連接酶、Taq酶和高保真DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基購自中科邁晨(北京)科技有限公司(Macgene公司)。

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；人IFN-γ ELISA檢測試劑盒購于廈門慧嘉生物科技有限公司；引物合成及DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 pcDNA3.1(-)-TIG-Fc真核表達載體的構(gòu)建

分別以TIGIT全長基因序列和含人IgG3 Fc段的質(zhì)粒為模板，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計TIGIT胞外段引物TIG-F和TIG-R，從TIGIT全長基因中擴增TIGIT的胞外段(TIG)；設(shè)計Fc段引物Fc-F和Fc-R，從含人IgG3 Fc段的質(zhì)粒中擴增Fc片段。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，去離子水補至25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物Fc-F在合成過程中加入一段連接肽(linker)DNA序列，便于通過PCR搭橋方式和Fc基因融合，從而實現(xiàn)2個片段間的重疊延伸過程(引物及l(fā)inker序列見表1)。然后分別將PCR產(chǎn)物中的人TIG和IgG3 Fc片段回收，以TIG-F和Fc-R為引物進行重疊PCR，擴增獲得TIG-Fc融合基因。擴增體系為：模板各1 μL，10×buffer 2.5 μL，Taq酶 0.3 μL，dNTP 2 μL，引物TIG-F和Fc-R各0.5 μL，去離子水補至25 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

將上述PCR擴增獲得的融合基因和載體pcDNA3.1(-)分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和NotⅠ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收酶切產(chǎn)物。將pcDNA3.1(-)載體與回收的DNA片段以3∶1的摩爾比，在T4連接酶作用下，于16 ℃連接過夜，以構(gòu)建pcDNA3.1(-)-TIG-Fc重組質(zhì)粒。隨后，通過DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化，將其產(chǎn)物取100 μL均勻涂布于LB/Amp的平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，再挑取平板上生長的單克隆于37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)16～18 h，再通過PCR擴增進行鑒定。擴增體系為：菌液 2 μL，TaqPCR Master Mix 10 μL，引物TIG-F和Fc-R各0.5 μL，去離子水補至25 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。選擇鑒定為陽性的菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進行雙酶切驗證后，交至生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

表1 本研究所用引物序列

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將人293T細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中；將NK-92細胞培養(yǎng)于含12.5%FBS、12.5%馬血清和終濃度100 U·mL-1重組人白細胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)的α-MEM培養(yǎng)液中。在真核細胞轉(zhuǎn)染的過程中，細胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期，待其狀態(tài)良好時進行實驗，根據(jù)LipofectamineTM2000的試劑說明瞬時轉(zhuǎn)染細胞，具體步驟如下：分別用約200 μL的無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋9 μL pcDNA3.1(-)-TIG-Fc(濃度為447 ng·μL-1)質(zhì)粒和10 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，充分混勻后室溫靜置5 min，然后將2管液體等量混合，輕輕混勻后靜置15 min即為轉(zhuǎn)染工作液。將細胞換至無血清培養(yǎng)液，將配置所得轉(zhuǎn)染工作液輕輕緩慢加入細胞中，于37 ℃孵育4～6 h后更換成10% FBS培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細胞進行檢測。

1.4 流式細胞儀檢測

采用脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染前1天，將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板內(nèi)，于不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第2天進行細胞轉(zhuǎn)染，細胞密度為80%左右，細胞分為空白組、陰性對照組(用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染完成后培養(yǎng)細胞48 h，用預(yù)冷PBS清洗細胞1次，然后每孔加入200 μL不含EDTA的胰酶消化液，放入孵箱內(nèi)，觀察細胞狀態(tài)，鏡下觀察細胞變圓、細胞間間隙加大時，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，以制備細胞懸液，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用300 μL 4%多聚甲醛重懸，室溫避光固定30 min后，PBS清洗3次；細胞膜打孔，加入200 μL 0.2% TritonX-100，室溫靜置20 min后再用PBS清洗2次，重懸細胞，每管加入PE標記的抗人TIGIT抗體5 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，棄上清，500 μL PBS重懸細胞，上機檢測TIG-Fc融合蛋白在細胞內(nèi)的表達水平。

1.5 Western blot法檢測

將對數(shù)生長期的人293T細胞接種于6孔板中，細胞分為空白組、陰性對照組(用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染組，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中，轉(zhuǎn)染完成后培養(yǎng)細胞24 h。隨后收集細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，進行蛋白質(zhì)電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，稀釋比例為1∶500，于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5次，每次5 min，洗滌后，加入二抗，稀釋比例為1∶1000，于37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min，用化學發(fā)光法顯色，以空白與陰性為對照，檢測TIG-Fc融合蛋白表達情況。

1.6 細胞增殖實驗

利用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc對NK-92細胞增殖能力的影響。取對數(shù)生長期的NK-92細胞，分別以6 000個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細胞分為空白組、陰性對照組(用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔200 μL溶液，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明瞬時轉(zhuǎn)染細胞，待轉(zhuǎn)染6 h后，換成含10%血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后更換為無血清培養(yǎng)基，之后每孔換為事先配好的WST-1溶液100 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～2 h，隨后，充分混勻待檢測體系，利用酶標儀檢測450 nm處吸光度，其吸光度(OD值)代表其增殖率[12]。

1.7 ELISA檢測

將pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)于6孔板的NK-92細胞中，細胞分為空白組、陰性對照組(用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染組，培養(yǎng)48 h后，吸取細胞培養(yǎng)上清，1 000 r·min-1離心20 min，吸取上清檢測即可。具體步驟如下：將預(yù)先純化的IFN-γ抗體包被微孔板于室溫平衡30 min，每孔加入100 μL待測樣品，37 ℃溫育2 h(每組樣品做3個復(fù)孔)，棄液體，甩干，每孔加檢測溶液A工作液100 μL，37 ℃溫育1 h，PBS洗板5次，再每孔加檢測溶液B工作液100 μL，37 ℃溫育1 h，再用PBS洗板5次，加入底物顯色液反應(yīng)30 min顯色，迅速終止反應(yīng)，在酶標儀450 nm波長處測量各孔吸光度(OD值)，按照標準曲線并結(jié)合OD值計算各組濃度，結(jié)果以pg·mL-1表示。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel軟件進行統(tǒng)計學分析，每組實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標準差”表示，采用單因素方差進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表達載體的構(gòu)建與鑒定

分別以TIGIT全長基因序列及含人IgG3 Fc段基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴增TIG和Fc的基因片段，產(chǎn)物長度分別為396 bp和744 bp(圖1A)。通過重疊PCR將2個片段拼接為TIG-Fc，產(chǎn)物長度為1 114 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證產(chǎn)物與理論基因片段長度一致(圖1B)。對TIG-Fc融合基因片段和pcDNA3.1(-)表達載體進行雙酶切，再經(jīng)T4連接酶連接，獲得重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc，隨機挑取7個單菌落進行菌液PCR驗證，結(jié)果顯示3～7號克隆的目的基因連接成功(圖1C)，取3號單克隆測序分析，測序結(jié)果表明TIG-Fc基因序列正確，無插入或缺失突變。

2.2 TIG-Fc融合蛋白在293T細胞中的表達

將pcDNA3.1(-)-TIG-Fc質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293T細胞中，利用流式細胞術(shù)檢測其蛋白表達情況。由圖2可知，在轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組中TIG-Fc融合蛋白表達較低，轉(zhuǎn)染組中TIG-Fc蛋白表達顯著升高，陽性率達77.14%(標記TIGIT)，轉(zhuǎn)染組與2個對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明融合質(zhì)粒構(gòu)建成功并在293T細胞中表達。

A：TIG和Fc的基因片段的電泳圖 M—DNA Marker(Takara 3519Q)，1—IgG3 Fc段基因，2—TIGIT胞外段(TIG)基因；B：重疊PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖 M—DNA Marker(Takara 3582Q)，1—重疊PCR擴增產(chǎn)物；C：菌液PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖 M—DNA Marker(Takara 3582Q)，1～7—1～7號單克隆PCR擴增產(chǎn)物。

注：M1：陽性細胞；Al：即All，所有細胞；Marker：分類；% gated：門內(nèi)細胞的百分比。

2.3 Western blot法鑒定轉(zhuǎn)染細胞系中融合蛋白的表達

將構(gòu)建成功的TIG-Fc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中，24 h后提取總蛋白，利用Western blot檢測其蛋白表達情況。由圖3可知，當用抗TIGIT抗體免疫印跡時，轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)目標條帶，分子量約為40 kDa，與TIG-Fc大小基本一致；而2個對照組無表達。這說明重組質(zhì)粒能夠在293T細胞中正確表達TIG-Fc融合蛋白。

2.4 TIG-Fc對NK細胞增殖的影響

將pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NK-92細胞系中，利用WST-1實驗檢測細胞的增殖情況。由圖4可知，轉(zhuǎn)染組的細胞增殖率(0.532±0.07)顯著低于陰性對照組(0.953±0.04)(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明過表達TIG-Fc能夠顯著抑制NK-92細胞的增殖，抑制率達50%左右。

注：A—空白對照組；B—陰性對照組；C—轉(zhuǎn)染組

注：不同小寫字母表示不同處理間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 TIG-Fc對NK-92細胞分泌IFN-γ水平的影響

由圖5可知，pcDNA3.1(-)-TIG-Fc轉(zhuǎn)染組的IFN-γ水平為(325.3±46.5)pg·mL-1，較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P<0.05)；而空白對照組和陰性對照組之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此推測，TIG-Fc可通過抑制NK-92細胞分泌IFN-γ，進而抑制NK細胞的增殖與活化。

注：不同小寫字母表示不同處理間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

近年來，TIGIT作為一種新進的抑制性分子，其與免疫細胞間的相互作用逐漸受到重視。TIGIT是NK細胞和T細胞共有的抑制性受體，歸類于CD28家族，與其配體PVR(CD155)、CD112結(jié)合后被激活，不僅可以抑制T細胞的功能，還能促進NK細胞的免疫抑制作用[13-15]。NK細胞是機體內(nèi)一種重要的免疫細胞，在抗腫瘤、抗病毒和抗胞內(nèi)寄生菌方面發(fā)揮著重要作用，NK細胞的活性是通過共刺激信號和共抑制信號之間的平衡來調(diào)控的，其參與抵抗腫瘤的第一道防線，NK細胞能夠通過其表面的一系列抑制性受體、活化性受體和粘附受體，來區(qū)分識別應(yīng)激轉(zhuǎn)化后的被感染的細胞和健康的細胞[16]。有研究指出：對外周血NK細胞表面的TIGIT表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者外周血NK細胞表面TIGIT的表達顯著低于健康對照組，且其表達與疾病活動度、抗體產(chǎn)生及炎癥程度相關(guān)，提示TIGIT可作為疾病活動度評價的指標[17]；PVR表達于肝細胞的表面，接受TIGIT配體的刺激，通過抑制NK細胞的功能，來減輕炎癥，促進肝細胞的再生[18]；CD226和CD96作為新發(fā)現(xiàn)的NK細胞表面活化性受體，在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用，但TIGIT與CD266和CD96同時活化時，TIGIT對NK細胞的抑制性作用占主導地位[8]。

為了進一步研究TIGIT蛋白對NK細胞增殖及分泌細胞因子功能的影響，本研究首先構(gòu)建了pcDNA3.1(-)-TIG-Fc的真核表達載體。在前期設(shè)計引物時，在TIG與Fc 2個基因間插入了一段柔性鏈，此段柔性肽的分子極性小，且富含甘氨酸和絲氨酸，易于彎曲，具有一定的彈性，使融合蛋白的2個部分有較大的間隔，保持活性必需的空間構(gòu)象，并且避免了融合蛋白的2個部分產(chǎn)生相互作用[19]。

在成功構(gòu)建TIG-Fc融合基因的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染至NK-92細胞中，研究發(fā)現(xiàn)，與2個對照組相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(-)-TIG-Fc質(zhì)粒的NK-92細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，并且細胞分泌IFN-γ的水平顯著降低(P<0.05)，表明TIG-Fc融合蛋白的表達可以影響NK細胞的功能。γ干擾素(IFN-γ)是Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，能夠激活NK細胞等，從而增強免疫應(yīng)答能力，是機體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分，具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用和抗病毒、抗腫瘤的作用[20]。TIG-Fc在NK-92細胞的過表達使細胞分泌IFN-γ 的水平降低，這也進一步表明TIG-Fc可以直接抑制NK細胞的活化。

綜上所述，本研究初步闡述了TIGIT對NK-92細胞增殖功能及分泌細胞因子功能的影響，但是TIGIT是如何發(fā)揮功能的,以及其分子機制仍有待深入研究。除此之外，TIGIT蛋白可以抑制多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，如遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity response，DTH)[6]、自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE)[7]、SLE[17]和小鼠的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)[21]。這些都和TIGIT蛋白對T細胞和NK細胞的抑制功能有關(guān)。也有研究報道阻斷TIGIT可重塑NK細胞的功能，從而抑制腫瘤生長[22]?？傊?，TIGIT作為新興的抑制分子，其在免疫調(diào)節(jié)疾病中的作用越來越突顯，也為后續(xù)研究疾病機制開闊了思路。