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        大鼠肝癌模型中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表達水平及其與腫瘤檢測的關(guān)系

        2020-02-27 06:41:42古麗米熱依米提斯坎德爾白克力王延蛟
        生物技術(shù)進展 2020年1期
        關(guān)鍵詞:肝癌水平檢測

        古麗米熱·依米提, 斯坎德爾·白克力, 王延蛟

        新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830011

        肝癌是常見的惡性腫瘤之一, 其發(fā)病機制與癌基因的激活有關(guān)[1]。目前,對癌癥發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在腫瘤相關(guān)基因的表達調(diào)控方面[2]。DEN二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)對人體和動物都存在劇毒性,即使是小劑量注射或口服給藥也會造成嚴(yán)重的肝損傷。DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型是目前研究分析人類肝細胞癌的發(fā)病機制和過程的理想動物模型[3]。非編碼小RNA與腫瘤類型密切相關(guān)[4]。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,PIWI相互作用RNA(piRNA)是一種非編碼RNA[5]。Aravin等[6]在雄性小鼠睪丸組織中分離出一段小RNA,該RNA主要與Argnaute家族PIWI蛋白成員相互作用而將其命名為piRNA,piRNA是長度約為24~31 nt的新型非編碼RNA,piRNA在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[7]。piRNA不僅參與生殖細胞的調(diào)控,而且在宮頸癌、胃癌、乳腺癌和膀胱癌等多種癌細胞中均檢測到piRNA的異常表達[8],piRNA與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明,PIWI和piRNA的表達水平與腫瘤類型密切相關(guān)。PIWI/piRNA調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性表達、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的修飾[9]。已有研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤中PIWI蛋白高表達,PIWI蛋白異常表達水平與腫瘤的惡性程度顯著相關(guān)[10]。PIWI可能還參與胃癌和其他癌癥的發(fā)展,并且是癌癥診斷的一個潛在標(biāo)記[11]。PIWIL2 mRNA在肝癌中的表達量比腫瘤周圍的肝臟組織的表達量高(P<0.05),Piwil2基因mRNA的表達與PIWIL2蛋白質(zhì)的表達相關(guān),PIWIL2有可能成為肝癌的檢測及治療的分子標(biāo)志物[12]。PIWIL2可以通過控制p53作為STAT3信號通路的正調(diào)節(jié),使p53基因發(fā)生修飾和沉默,從而抑制腫瘤細胞的凋亡發(fā)揮癌基因的作用[13]。PIWI/piRNA通路相關(guān)基因Piwil4、Mael和Ddx4作為候選癌基因在多種癌組織中表達,而在肝癌組織中的研究尚未見相關(guān)報道。

        本研究以建立的大鼠肝癌動物模型為研究對象,通過ELISA方法檢測肝癌模型各組血清腫瘤標(biāo)記物驗證大鼠肝癌病證動物模型;采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-blot)和免疫組織化學(xué)方法分別檢測肝癌模型組織中Piwil4、Mael、Ddx4基因mRNA和蛋白的表達水平,探討Piwil4、Mael、Ddx4基因在肝癌中表達水平變化的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        選取健康雄性40只Wistar大鼠(提供單位:新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,動物合格證號:65000700000538),體重約(150±10)g,月齡約為6月。DEN購自Sigma公司。Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH引物合成自上海生工公司,Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體購自ABCAM公司,RNA提取試劑盒購自聚合美生物公司,蛋白裂解液購自Thermo公司。

        1.2 肝癌動物模型建立與分組

        選取雄性Wistar大鼠40只,飼養(yǎng)3 d后大鼠隨機分成肝癌模型組(自由飲用滅菌水配制的濃度為0.1 mg·mL-1的DEN 溶液,20只)和正常對照組(飲用滅菌水,普通飼料飼養(yǎng),20只)。滿20周處死動物并取肝組織 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 觀察大鼠肝癌模型肝組織病理形態(tài)學(xué)特征

        分別取肝癌組小鼠肝組織和正常組小鼠肝組織,4% PFA溶液固定,石蠟包埋兩組肝組織切片,HE染色,顯微鏡下觀察病理切片檢測組織形態(tài)特征。

        1.4 酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)測定模型各組中的腫瘤標(biāo)記物(HSP、ARF、ASMA)

        取血后,室溫下血液凝固2 h,4 ℃過夜,離心(3 000 r·min-1,4 ℃,10 min),棄不溶物,將血清移至試管,置于-80 ℃保存。按照AFP-L3、HSP-70、ASMA ELISA試劑說明書要求,配標(biāo)準(zhǔn)曲線(AFP:64、32、16、8、4、0 ng·mL-1;HSP:400、200、100、50、25、0 pg·mL-1;ASMA:200、100、50、25、12.5、0 IU·L-1),加入標(biāo)準(zhǔn)液,加入樣品,洗滌,測450 nm分光光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組血清中腫瘤標(biāo)記物的表達量。

        1.5 實時熒光定量(qRT-PCR)法檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達

        用加強型組織/細胞RNA快速提取試劑盒(聚合美生物公司)提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用引物均由上海生工公司合成,引物序列見表1。

        實時熒光定量qRT-PCR按 SYBR Green RT-PCR試劑盒的操作步驟進行。充分混勻以上反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL SYBR Premix ExTaqTM,10.3 μL dd H2O,1 μL cDNA模板,1.6 μL上游引物,1.6 μL下游引物。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,Tm30 s,40個循環(huán);95 ℃ 10 s延伸,40個循環(huán)(由設(shè)定點溫度增加0.5 ℃/s)。結(jié)果用目的基因在肝癌模型組相對于正常對照組的mRNA相對模板表達量差異倍數(shù)用2-ΔΔCt方法來計算,其中ΔΔCt=(CtTarget-CtGAPDH)處理-(CtTarget-CtGAPDH)對照。

        表1 實時熒光定量PCR引物序列及擴增片段

        1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因在蛋白的表達

        20周后處死動物并取各組肝組織立即用液氮研磨,加蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA試劑盒對總蛋白進行定量。加6×電泳上樣緩沖液沸水浴10 min,SDS-PAGE電泳(80 V 30 min,100 V 40 min),PVDF轉(zhuǎn)膜(80 mA,2 h 30 min),封閉,一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH 1∶5 000; PIWIL4 1∶1 000;MAEL 1∶2 000;DDX4 1∶1 000),TBST洗膜5次,HRP標(biāo)記(山羊抗兔1∶10 000)的二抗孵育2 h,TBST洗膜5次,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行曝光。

        1.7 免疫組織化學(xué)法檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因的蛋白表達水平

        60 ℃溫箱中烘烤60 min;二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡15 min,95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡5 min,洗滌;用沸騰的10 mmol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液洗滌,3% H2O2-甲醇溶液中洗滌15 min,5%山羊血清室溫封閉40 min,加一抗過夜,洗滌,加酶標(biāo)二抗孵育40 min,洗滌,DAB顯色液顯色10 min,蒸餾水終止顯色,蘇木素染液復(fù)染10 min,脫色反藍,封片,顯微鏡拍片。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果與分析

        2.1 肝癌組織病理形態(tài)學(xué)特征

        成功建立大鼠肝癌模型,正常組大鼠肝組織細胞結(jié)構(gòu)完整,肝細胞排列規(guī)則,細胞核形態(tài)正常。肝小葉結(jié)構(gòu)正常,未見纖維間隔,未見細胞水腫,未見壞死肝細胞(圖1)。肝癌模型組大鼠肝細胞呈多角形,異型性明顯,胞漿豐富,嗜酸性,核大,圓形,有清楚的核仁。分化差異癌細胞異型性明顯,常有巨核及多核瘤細胞(圖1)。

        圖1 HE染色觀察肝臟病理形態(tài)特征

        2.2 肝癌模型組織中腫瘤標(biāo)記物(HSP、ARF、ASMA)表達水平

        結(jié)果(圖2)表明,腫瘤標(biāo)記物AFP肝癌模型組(6.70±3.17)與正常對照組(0.98±0.13)差異極顯著(P<0.05);腫瘤標(biāo)記物ASMA肝癌模型組(62.63±2.65)與正常對照組(48.09±4.23)差異極顯著(P<0.05);腫瘤標(biāo)記物HSP肝癌模型組(27.43±3.18)與正常對照組(6.64±4.57)差異極顯著(P<0.05)。

        圖2 肝癌模型組織中腫瘤標(biāo)記物表達變化

        2.3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達水平

        結(jié)果(圖3)表明,肝癌模型組織中Piwill4、Mael和Ddx4mRNA相對表達水平分別為114.8±15.74、5.66±2.02、15.07±6.17,正常對照組mRNA相對表達水平分別為1.18±0.23、1.27±0.27、1.57±0.49。在肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA表達水平明顯高于正常肝組織(P<0.05)。

        2.4 Western-blot法檢測肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平

        結(jié)果(圖4)表明,肝癌模型組中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平分別為2.23±0.49、0.14±0.02、1.36±0.12,正常對照組蛋白表達水平分別為0.85±0.15、0.04±0.05、0.71±0.11。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4 蛋白表達水平明顯高于對應(yīng)的正常肝組織(P<0.05)。

        圖3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4 mRNA的相對表達水平

        圖4 肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平

        2.5 免疫組織化學(xué)法檢測肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平

        結(jié)果(圖5)表明,肝癌模型組中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平分別為879.9±12.64、904.6±8.73、874.8±7.95,正常對照組蛋白表達水平分別為292.0±3.55、343.1±8.05、290.5±6.09。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平明顯高于對應(yīng)的正常肝組織,在肝癌模型組織中高表達(P<0.05)。

        圖5 PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白的表達水平

        3 討論

        肝癌是常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著人類健康,目前認為其發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素雙重影響。對肝癌的發(fā)生及發(fā)展主要集中在腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控等方面的研究。

        PIWI/piRNA不僅在人睪丸和造血干細胞大量表達,也在多種腫瘤組織和腫瘤細胞株有異常表達。在乳腺癌等腫瘤中,PIWI蛋白在腫瘤表達量與惡性程度呈正相關(guān)[14]。PIWI蛋白含量用于判斷腫瘤惡性程度在胃癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌、肉瘤和肝細胞癌的研究中已得到證實[15]。

        Piwil2與Piwil4都是PIWI家族亞成員,PIWIL2在惡性腫瘤中過度表達使抑癌基因沉默,促進腫瘤的發(fā)展[16]。Piwil2基因的高表達誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-xL的過表達,引起STAT3基因的表達上升,激活STAT3/BCL-XL通路抑制腫瘤細胞凋亡[17]。在結(jié)腸癌及其癌旁組織中,Piwil2的異常表達可促進腫瘤的轉(zhuǎn)移與病人生存期呈負相關(guān)[18]。PIWIL4蛋白參與修復(fù)p53蛋白的突變,促進p53蛋白發(fā)揮功能[19],PIWIL4蛋白的低表達會影響miRNA的穩(wěn)定性[20]。2010年蘇暢等[21]發(fā)現(xiàn)Piwil4基因在人宮頸癌組織中的表達水平較正常組織髙,能夠促進細胞的生長活性和增殖能力,并能抑制其凋亡。

        Mael與Ddx4(Vasa)基因與PIWI通路相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)Mael基因在結(jié)直腸癌等癌組織中異常高表達[22]。徐景波等[23]研究發(fā)現(xiàn)DDX4高表達與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。李斌等[24]研究發(fā)現(xiàn),靶向沉默Ddx4基因可明顯抑制裸鼠食管鱗癌細胞成瘤,Ddx4基因沉默可能是通過抑制 PI3K的活性,由此參入并下調(diào) PI3K/Akt 信號通路,進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

        本研究對肝癌模型中的腫瘤標(biāo)記物在肝癌模型組織中的腫瘤標(biāo)記物含量高于正常對照組含量,可以推測腫瘤標(biāo)記物在肝癌模型組織中的表達升高。qRT-PCR及Western-blot方法檢測,結(jié)果表明肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表達水平明顯高于對應(yīng)的正常組織(P<0.05)。Piwil基因mRNA的表達與PIWIL蛋白質(zhì)的表達有相關(guān)性。提示Piwi基因的mRNA表達及蛋白表達與肝癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)。綜上所述,研究表明,Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型組織中高表達,對肝癌的早期診斷提供一定的依據(jù)。肝癌模型組織中PIWI基因表達水平有望作為肝癌的檢測及治療的一種分子標(biāo)志物。

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