馬雪梅, 張?chǎng)? 謝飛, 趙鵬翔, 張昭, 儀楊, 張曉康, 馬勝男, 李秦劍, 呂寶北, 劉夢(mèng)昱, YAO Mawulikplimi Adzavon, 孫學(xué)軍, 李英賢

1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124；

2.上海交通大學(xué)氫科學(xué)中心, 上海 200240;

3.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心, 北京 100094

氫氣生物學(xué)的研究歷史很短，它一直被認(rèn)為是生理惰性氣體，曾經(jīng)作為配氣在潛水中使用。1969年Levitt等[1]報(bào)道人的腸道菌會(huì)產(chǎn)生氫氣，99%的氫氣在大腸中主要由腸道厭氧細(xì)菌產(chǎn)生，食物可以使腸道產(chǎn)氫效率提高7～30倍，但那時(shí)氫氣被作為代謝廢氣對(duì)待。1975年在人類歷史上首次發(fā)現(xiàn)氫氣的醫(yī)學(xué)效應(yīng)，美國(guó)學(xué)者Dole等[2]在Science報(bào)道，連續(xù)14天吸入8個(gè)大氣壓氫氣能夠明顯減少小鼠皮膚癌，然而由于高壓氫氣難于控制，這篇文章并未引起廣泛關(guān)注。日本醫(yī)科大學(xué)Ohsawa等[3]于2007年在NatureMedcine上發(fā)表論文，證明吸入少量氫氣(2%)可以有效保護(hù)缺血再灌注造成的大鼠腦損傷。由于氫氣是一種為人們熟知的氣體，反應(yīng)的產(chǎn)物只有水，至今尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)人體的毒性作用，氫氣的疾病治療作用意味著這種氣體可能在醫(yī)療上具有廣泛潛在的應(yīng)用前景，因此這一研究迅速受到國(guó)際生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。大量的研究證明氫氣對(duì)逾百種疾病具有潛在的治療作用，如各類缺血再灌注損傷、動(dòng)脈硬化和糖尿病等代謝類疾病、神經(jīng)退行性疾病癥狀的改善、腫瘤防治、抗炎和戒毒等[4]。氫氣對(duì)植物也有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括在植物抗鹽、抗鋁毒、鎘毒、汞毒、緩解百草枯帶來的氧化損傷等非生物脅迫反應(yīng)中具有保護(hù)作用[5]。

氫氣生物學(xué)雖然快速發(fā)展，但是關(guān)于氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)理一直都有爭(zhēng)論。目前主要有三種假說：一是被廣泛接受的氫氣選擇性清除毒性自由基的假說；二是生物酶假說，作者團(tuán)隊(duì)首先報(bào)道了氫氣促進(jìn)乙酰膽堿酯酶活性[6]，隨后證明氫氣可以作用于辣根過氧化物酶(HRP)、線粒體復(fù)合物Ⅰ等生物酶(未發(fā)表數(shù)據(jù)，2018年氫分子生物醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)報(bào)告)，氫氣與生物大分子的作用值得關(guān)注；三是信號(hào)分子假說，由于缺乏明確的直接作用靶點(diǎn)，該假說不作為本文討論的重點(diǎn)。

1 氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)理

1.1 氫氣清除自由基假說

Dole等[2]認(rèn)為氫氣具有還原性，氫與羥自由基(hydroxyl radical，·OH)的反應(yīng)是治療腫瘤的基礎(chǔ)；Ohsawa等[3]提出氫氣發(fā)揮功能的基礎(chǔ)是選擇性清除·OH和過氧亞硝酸根(peroxynitrite，ONOOH)等毒性自由基。之后的很多研究都證明在氫氣的作用過程中有自由基的減少，與活性氧相關(guān)的SOD、CAT、GSSH、MDA等也發(fā)生變化，氫氣的抗氧化作用得到廣泛認(rèn)可。但是，氫氣的抗氧化作用是直接與自由基反應(yīng)清除已經(jīng)產(chǎn)生的自由基還是減少自由基的生成？目前被廣泛接受的是氫氣選擇性清除自由基的理論，但本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這一理論很難成立，主要是基于現(xiàn)有的研究并不能充分證明氫氣與自由基在生理?xiàng)l件下能夠直接反應(yīng)。

1.1.1氫氣與自由基反應(yīng)常數(shù) 細(xì)胞內(nèi)能夠與·OH發(fā)生反應(yīng)的成分，如膜脂、GSSH等，不僅含量遠(yuǎn)大于氫氣，而且反應(yīng)常數(shù)(1×1010M-1·s-1)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于·OH和氫氣的反應(yīng)常數(shù)(4.2×107M-1·s-1) 。因此，氫氣與·OH的反應(yīng)常數(shù)太低并不足以支持其優(yōu)先于體內(nèi)大量存在的高反應(yīng)常數(shù)的底物發(fā)生反應(yīng)，特別是在氫濃度不高的情況下[7]。

1.1.2無細(xì)胞體系中氫氣與羥自由基的反應(yīng)

Ohsawa等[2]證明氫氣與·OH直接反應(yīng)的體外體系是芬頓反應(yīng)，然而芬頓反應(yīng)在不同[Fe2+]/H2O2比值下·OH產(chǎn)生量會(huì)受到氧氣濃度的極大影響[8]。本團(tuán)隊(duì)采用不同[Fe2+]/H2O2比值，以氮?dú)饨M為對(duì)照，HPF熒光法檢測(cè)·OH的量(未發(fā)表數(shù)據(jù)，2017年中國(guó)醫(yī)促會(huì)氫分子生物醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)報(bào)告)，發(fā)現(xiàn)在H2O2濃度為1 mmol·L-1([Fe2+]/H2O2為1∶10) 時(shí)的HPF熒光信號(hào)強(qiáng)度高于H2O2濃度為5 μmol·L-1([Fe2+]/H2O2為20∶1) 時(shí)的HPF熒光信號(hào)強(qiáng)度，這說明H2O2濃度為1 mmol·L-1時(shí)產(chǎn)生了比較多的自由基。但是氫氣組的HPF熒光信號(hào)與對(duì)照組相比沒有降低，表明氫氣并沒有與·OH反應(yīng)；H2O2濃度為5 μmol·L-1時(shí)，氫氣組的 HPF熒光信號(hào)與對(duì)照組相比降低，但是由于加入氣體可能影響溶液的含氧量，本團(tuán)隊(duì)以通入氮?dú)獾娜芤鹤鳛閷?duì)照，發(fā)現(xiàn)氮?dú)饨M的HPF信號(hào)也降低了(未發(fā)表數(shù)據(jù)，2017年氫分子生物醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)報(bào)告)。說明在此條件下，·OH產(chǎn)量的變化容易受到氧氣 濃度的影響。因而我們認(rèn)為Ohsawa等提出的氫氣與·OH直接反應(yīng)的體外體系由于H2O2的濃度很低，自由基的產(chǎn)生容易受到反應(yīng)條件的影響，并不能充分證明氫氣與·OH發(fā)生了反應(yīng)。Penders等[9]的研究也證明氫氣不能通過與ONOOH反應(yīng)發(fā)揮功能。

1.1.3細(xì)胞中氫氣與羥自由基的反應(yīng) Ohsawa等[2]證明氫氣清除·OH的三個(gè)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)都是選用 PC12細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用線粒體呼吸鏈抑制劑antimycin A誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)，通過HPF熒光和ESR發(fā)現(xiàn)氫氣可以減少·OH。在這些實(shí)驗(yàn)中，自由基信號(hào)的減弱既可能是因?yàn)樽杂苫漠a(chǎn)生減少了，也可能是因?yàn)樽杂苫a(chǎn)生之后被清除了，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及和自由基相關(guān)的SOD、CAT、GSSH、MDA等指標(biāo)的變化并不能分辨自由基產(chǎn)生和清除的區(qū)別，因此尚需要更進(jìn)一步的證據(jù)證明。

1.1.4體外超聲乳化體系中氫氣與羥自由基的反應(yīng) 另一個(gè)證據(jù)證明氫與·OH直接反應(yīng)的研究是氫氣對(duì)白內(nèi)障超聲乳化治療導(dǎo)致的角膜損傷的保護(hù)作用[10]。超聲乳化治療白內(nèi)障過程中，超聲波誘導(dǎo)羥基自由基的形成，能破壞角膜內(nèi)皮細(xì)胞，研究采用ESR 和HPF熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)氫能減少·OH，從而減少內(nèi)皮氧化損傷。超聲反應(yīng)會(huì)有空化效應(yīng)，即會(huì)產(chǎn)生很多小的氣泡，空化氣泡內(nèi)極高的溫度(幾千攝氏度)和壓力(數(shù)百個(gè)大氣壓)導(dǎo)致水分子發(fā)生熱分解，進(jìn)而在氣泡邊界產(chǎn)生·OH，這種高溫高壓的特殊微環(huán)境下，氫氣與·OH反應(yīng)能力極大增強(qiáng)，從而增加了氫氣與·OH反應(yīng)的可能性；同時(shí),加入氫氣的排氧效應(yīng)也可以減少·OH產(chǎn)生[11]。因而，實(shí)驗(yàn)有可能觀測(cè)到加入氫氣后·OH的減少。這個(gè)研究屬于特殊的體外條件下氫氣和自由基反應(yīng)的例子，并不能代表氫氣在生理狀態(tài)下與自由基的反應(yīng)。

總之，現(xiàn)有的關(guān)于生理?xiàng)l件下氫氣與自由基直接反應(yīng)的證據(jù)并不充分，多數(shù)屬于間接證據(jù)，無法區(qū)分氫氣是與自由基直接反應(yīng)還是影響了自由基的產(chǎn)生。

1.2 生物酶假說

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)是存在于膽堿能突觸間的神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，該酶能降解乙酰膽堿、終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，并保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。越來越多的證據(jù)表明，AchE在神經(jīng)再生、神經(jīng)退行性疾病等方面發(fā)揮重要作用[12]。本團(tuán)隊(duì)2014年發(fā)現(xiàn)氫氣可以在體外與AchE作用，提高酶活性[6]，這也是到目前為止氫與生物酶直接作用的唯一報(bào)道。AchE的活性中心含有由Ser200、His400和 Glu327 組成的催化三聯(lián)體，即“His-Ser-Glu催化鐵三角”(圖1)[12]，氨基酸之間的連接與電子轉(zhuǎn)移都是靠氫鍵等次級(jí)鍵，氫氣可能在氫鍵的形成與電子重排中發(fā)揮作用。

為了更方便地研究酶與氫氣的相互作用，本團(tuán)隊(duì)選擇辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)作為研究對(duì)象，HRP是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，同類蛋白包括細(xì)胞色素氧化酶、過氧化物酶、細(xì)胞色素P450超家族、一氧化氮合酶等眾多重要的生物酶[13]，這類酶的活性中心含有鐵卟啉，在含有過氧化氫的溶液中酶的活性中心可以產(chǎn)生氧化性很強(qiáng)的高價(jià)鐵自由基中間態(tài)。如果氫氣可以直接與活性中心的高價(jià)鐵自由基反應(yīng)，HRP的酶活應(yīng)該降低。但本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，加入氫氣后HRP的酶活性升高，熒光光譜和紫外光譜研究發(fā)現(xiàn)氫氣可以影響酶活性中心的微環(huán)境(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因而推測(cè)，由于氫氣分子很小，其可以在分子表面，也可以進(jìn)入分子內(nèi)部，通過氫鍵等弱相互作用影響酶活性，AchE和HRP酶活的升高可能與此有關(guān)。

圖1 乙酰膽堿酯酶的活性中心[12]

2 高等生物中的氫化酶活性

氫化酶是存在于細(xì)菌、古細(xì)菌和藻類中的一類金屬酶，主要存在于自然界厭氧微生物體內(nèi)，它能夠催化氫氣的氧化或者質(zhì)子的還原這一可逆的化學(xué)反應(yīng)：H2H++H-2H++2e-[14]。

地球大約形成于46億年前，那時(shí)候地球溫度很高，從火山中噴出的氣體，如水蒸氣、氫氣、氨、甲烷、二氧化碳、硫化氫等，構(gòu)成了原始的大氣層。地質(zhì)證據(jù)表明生命開始于地球誕生10億年之后，早期地球的大氣中充滿氫氣，含量達(dá)到40%，是一個(gè)適宜生命生長(zhǎng)的環(huán)境，氫化酶在這個(gè)時(shí)期的原始生命產(chǎn)生過程中被“創(chuàng)造”出來是合乎邏輯的[15]。目前證明，有大量微生物可以利用氫氣作為能源，也有很多微生物可以產(chǎn)生氫氣，這得益于它們體內(nèi)的氫化酶。

真核生物的起源有多種理論，Martin等[16]認(rèn)為氫氣是推動(dòng)真核生物進(jìn)化的關(guān)鍵因素。他們認(rèn)為真核生物是由一種厭氧的、依賴氫氣的嚴(yán)格自養(yǎng)的古細(xì)菌(宿主)和一種能夠呼吸、厭氧異養(yǎng)代謝產(chǎn)生分子氫作為廢物的真細(xì)菌(共生體)共生而產(chǎn)生的，隨著地球環(huán)境氫氣來源的減少，宿主會(huì)嚴(yán)格地依賴于異養(yǎng)真細(xì)菌共生體，這提供了一種強(qiáng)大的選擇力，不可逆轉(zhuǎn)地將共生體和宿主聯(lián)系起來，如果共生體逃逸，宿主會(huì)立即餓死。因此這些宿主緊緊地依附于共生體，并且盡量選擇大表面積的宿主細(xì)胞形狀包圍共生體(而不是內(nèi)吞共生體，因?yàn)榧?xì)菌沒有細(xì)胞骨架)，增加接觸面，以便獲得更多的H2和CO2。宿主比表面積的增加使其自身受益，但這種環(huán)境對(duì)共生體的代謝造成損害，也降低了共生體產(chǎn)生氫來為宿主提供燃料的能力。隨著適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化選擇，宿主可以利用自身與環(huán)境的表面攝入有機(jī)質(zhì)并提供給共生體，宿主對(duì)氫的代謝依賴性消失了，厭氧環(huán)境的限制也消失，成為異養(yǎng)類型，共生體成為現(xiàn)在線粒體、氫化酶體等的前體。如果這一進(jìn)化路徑是正確的，真核生物共生體的氫氣代謝功能可能不會(huì)喪失，而是留在線粒體等結(jié)構(gòu)中隨時(shí)可能因?yàn)榄h(huán)境的變化而恢復(fù)。

真核生物線粒體的電子傳遞鏈?zhǔn)悄芰看x的核心部位，復(fù)合物Ⅰ(NADH:泛醌氧化還原酶，EC 1.6993)在線粒體以及細(xì)菌的呼吸鏈中廣泛存在，可以催化NADH的氧化和泛醌的還原以及質(zhì)子的泵出。線粒體中，三羧酸循環(huán)和脂肪β-氧化等過程的脫氫酶催化反應(yīng)脫下的2H是由NAD+接受，形成NADH，復(fù)合物Ⅰ由基質(zhì)接受還原型NADH中的2個(gè)H和2個(gè)e傳遞給黃素單核苷酸(FMN)形成FMNH2，F(xiàn)MNH2再經(jīng)一系列鐵硫中心(FeS)，將電子傳遞到泛醌(CoQ)。每次傳遞電子過程同時(shí)可偶聯(lián)將4個(gè)質(zhì)子從內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵到內(nèi)膜胞質(zhì)側(cè)，形成膜電位推動(dòng)ATP的產(chǎn)生。

線粒體復(fù)合物Ⅰ由NADH脫氫酶模塊(N-module，NuoE、NuoF和NuoG亞基)、醌模塊(Q-module，NuoC、NuoI、NuoB和NuoD亞基)和質(zhì)子泵模塊(P-module, NuoA, H, J, K, L, M 和N亞基)組成(圖2A)，復(fù)合物Ⅰ與氫化酶的同源性和進(jìn)化關(guān)系已有許多報(bào)道[17-21]。復(fù)合物Ⅰ的核心是由14個(gè)“核心”亞單位(7個(gè)親水亞單位和7個(gè)疏水亞單位)組成的L型復(fù)合物，這些亞基從原核生物到真核生物的線粒體都是保守的，真核生物的線粒體復(fù)合物Ⅰ含有31個(gè)額外的輔助亞單位。形成復(fù)合物Ⅰ的14個(gè)“核心”亞單位與氫化酶的大/小亞基相比較在結(jié)構(gòu)上高度保守，包括N2簇(復(fù)合物Ⅰ中NADH脫氫酶模塊末端FeS簇)、質(zhì)子通道和相似的催化中心結(jié)構(gòu)。N-module的NuoE、NuoF有NADH結(jié)合位點(diǎn)、FMN和FeS簇，NuoG與唯鐵氫化酶(Fe-only hydrogenase)類似，在復(fù)合物Ⅰ中提供FeS簇參與電子傳遞。存在于許多厭氧或兼性厭氧微生物中的能量轉(zhuǎn)換氫化酶(energy-converting hydrogenase, Ech)與復(fù)合物Ⅰ的“核心”亞基序列上高度相似[17]。此外，復(fù)合物Ⅰ還與一類膜結(jié)合的能將底物氧化和氫還原活化質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的鎳鐵氫化酶相似[18]。醌模塊可以接受來自N模塊的電子并傳遞給CoQ，NuoB和NuoD亞基與可溶性鎳鐵氫化酶(NiFe-hydrogenases)的大小亞基相似，CoQ的結(jié)合位點(diǎn)與氫化酶中的NiFe活性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)[19-21]。

A：線粒體復(fù)合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)模式圖; B：以BV作為電子受體檢測(cè)氫對(duì)離體線粒體復(fù)合物Ⅰ電子傳遞的影響

3 細(xì)胞的氫代謝

3.1 線粒體的氫代謝

3.1.1線粒體復(fù)合物Ⅰ的產(chǎn)氫活性 高等生物產(chǎn)生氫氣在植物中早有報(bào)道，1961年Sanadze[22]首次證明植物的葉可以吸收和釋放氫氣，后來發(fā)現(xiàn)小麥、大麥、玉米、擬南芥等都可以產(chǎn)生氫氣。雖然有研究證明葉綠體具有產(chǎn)生氫氣的能力[23]，但是對(duì)于線粒體是否能產(chǎn)生氫氣還沒有報(bào)道，線粒體復(fù)合物Ⅰ一直被認(rèn)為失去了氫代謝的能力。結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為復(fù)合物Ⅰ可能具有氫代謝的能力，但是一直缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體復(fù)合物Ⅰ可以產(chǎn)生氫氣，并且產(chǎn)氫的位點(diǎn)在FeS簇末端N2傳遞電子至CoQ的位置，氫代謝與TCA循環(huán)的代謝調(diào)節(jié)偶聯(lián)，特別與TCA代謝中間物琥珀酸、ɑ-酮戊二酸、延胡索酸以及CoQ密切相關(guān)[24]。

3.1.2氫氣影響線粒體復(fù)合物Ⅰ的酶活性 復(fù)合物Ⅰ催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到CoQ受體的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)。加入抗霉素A和疊氮化鈉分別抑制復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ的活性，在340 nm檢測(cè)NADH氧化后峰值的降低確定復(fù)合物Ⅰ的活性，溶液中溶入氫氣可以排氧，為測(cè)試缺氧條件下的酶活性，用氮?dú)馓幚斫M作為對(duì)照。結(jié)果顯示，氫氣組的酶活性明顯高于氮?dú)饨M(圖3)，這也表明在缺氧情況下氫對(duì)復(fù)合物Ⅰ的活性有保護(hù)作用(未發(fā)表數(shù)據(jù)，2018年氫分子生物醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)報(bào)告)。

3.1.3氫氣可以提高線粒體膜電位 線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子泵可將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子泵入膜間隙，質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)使得線粒體膜間隙積累大量質(zhì)子，形成跨線粒體內(nèi)膜的電位 (ΔΨ)，簡(jiǎn)稱為線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)。正常線粒體膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的前提，人體的ATP有95%為線粒體所提供。線粒體復(fù)合物Ⅰ是主要的質(zhì)子泵，每傳遞一對(duì)電子就會(huì)泵出4個(gè)質(zhì)子。本團(tuán)隊(duì)測(cè)定了多種細(xì)胞的線粒體膜電位，細(xì)胞在含氫培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，JC-1染色后檢測(cè)線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)氫處理可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞線粒體的膜電位(圖4)，結(jié)果表明氫促進(jìn)了質(zhì)子梯度的形成，點(diǎn)燃了線粒體跨膜電位的“生命之火”，但這一過程并不增加活性氧水平(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

圖3 氫氣影響線粒體復(fù)合物Ⅰ的酶活性

圖4 氫提高C6細(xì)胞的線粒體膜電位

3.1.4氫氣與線粒體活性氧的產(chǎn)生 活性氧(reaction oxygen species, ROS)在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)答、損傷修復(fù)、衰老等過程中發(fā)揮著重要的作用。在線粒體的電子傳遞過程中，電子沿著一系列的電子傳遞體傳遞給氧生成水。但是，位于呼吸鏈底物端的一些物質(zhì)，如黃素蛋白、非血紅素鐵蛋白(non-heme iron proteins)、醌，尤其是半醌等發(fā)生氧化還原的能障是很低的，常常直接將電子傳給O2產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，再被SOD等轉(zhuǎn)化為H2O2進(jìn)而形成·OH等活性氧(圖2A)。線粒體中FMN和NADH脫氫酶的鐵硫中心是O2-產(chǎn)生的主要部位，特別是復(fù)合物Ⅰ對(duì)CoQ 的過度還原會(huì)形成大量的活性氧[25]。

氫氣被認(rèn)為有清除·OH的作用，我們認(rèn)為氫氣在生理?xiàng)l件下并不能與·OH直接反應(yīng)，但大量的研究又證明氫氣有抗氧化作用，因而我們推測(cè)氫氣有可能在源頭減少自由基的產(chǎn)生，也就是在電子傳遞給O2產(chǎn)生 O2-這一步發(fā)揮作用，即具有在自由基產(chǎn)生之初關(guān)上“閥門”的開關(guān)作用。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本團(tuán)隊(duì)以芐基紫精(benzyl viologen，BV)作為電子受體代替CoQ檢測(cè)氫氣的作用(圖2A)。由于CoQ的吸收峰在270～280 nm處，與蛋白質(zhì)的吸收峰重合，因此很難通過檢測(cè)CoQ的還原來研究電子在復(fù)合物Ⅰ的傳遞過程。BV接受電子的位點(diǎn)主要位于復(fù)合物Ⅰ的鐵硫簇，其吸收峰在570～600 nm，本團(tuán)隊(duì)在研究中用BV代替CoQ作為電子受體檢測(cè)電子從NADH通過復(fù)合物Ⅰ的傳遞過程。反應(yīng)中加入抗霉素A和疊氮化鈉分別抑制復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ活性，加入Na2S2O4啟動(dòng)反應(yīng)，在570 nm處實(shí)時(shí)檢測(cè)還原型BV的信號(hào)。結(jié)果顯示，加入氫氣后可以明顯抑制電子傳遞到BV(圖2B)，表明氫氣可能在電子經(jīng)過復(fù)合物Ⅰ的傳遞過程中抑制活性氧的產(chǎn)生(未發(fā)表數(shù)據(jù)，2018年氫分子生物醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)報(bào)告)。

BV是PD、AD等神經(jīng)退行性疾病的誘發(fā)劑，可以從線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ接受電子傳遞給O2產(chǎn)生O2-等活性氧自由基，對(duì)細(xì)胞造成損害，氫氣對(duì)BV接受電子的抑制也表明氫氣在對(duì)抗活性氧產(chǎn)生方面的功能，特別在活性氧爆發(fā)時(shí)，這種源頭控制顯得尤為重要。本團(tuán)隊(duì)用電鏡研究氫氣對(duì)線粒體的保護(hù)作用，有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱造成腦神經(jīng)元線粒體減少、溶脹、基質(zhì)空間增大、嵴的破壞和非晶基質(zhì)密度的出現(xiàn)，氫氣可以保護(hù)線粒體，明顯減少損傷，增加線粒體的數(shù)量[6]，這些結(jié)果為氫氣對(duì)抗毒性物質(zhì)損害提供了依據(jù)。

3.1.5氫氣對(duì)細(xì)胞的代謝重編程 線粒體在生命活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用，作為生物體重要的能量工廠，線粒體是氧化磷酸化的場(chǎng)所，同時(shí)也負(fù)責(zé)連接糖酵解、氨基酸代謝、核苷酸代謝等重要的生命過程。氫氣對(duì)線粒體的作用必然影響細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)調(diào)控，如氫氣與線粒體復(fù)合物Ⅰ的作用會(huì)改變?nèi)人嵫h(huán)(TCA)α-酮戊二酸、琥珀酸等的代謝，這些物質(zhì)是HIf-1、α-酮戊二酸依賴的非血紅素鐵氧化酶的重要調(diào)節(jié)物，也可以調(diào)節(jié)TET (ten eleven translocation) 家族的表達(dá)，通過甲基化等表觀遺傳修飾發(fā)揮作用[26-28]。

腫瘤在很多情況下是一種代謝障礙性疾病，腫瘤細(xì)胞線粒體功能受損，主要利用糖酵解途徑生長(zhǎng)。本團(tuán)隊(duì)研究腦膠質(zhì)瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，氫氣對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺死作用有限，但可以誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化[29]，進(jìn)一步的研究表明，這一過程中腫瘤細(xì)胞由于氫氣的作用發(fā)生了代謝重編程(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這可以進(jìn)一步解釋為什么氫氣對(duì)眾多的腫瘤都能發(fā)揮作用，同時(shí)也可以解釋對(duì)于不同代謝類型的腫瘤，氫氣的作用會(huì)有差別。

3.2 細(xì)胞膜的氫代謝

細(xì)胞膜(cell membrane)又稱細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane，PM)，是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，它保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。質(zhì)膜上存在的氧化還原系統(tǒng)，如NADH-氧化還原酶類、NADPH-氧化酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、蘋果酸脫氫酶等，與許多細(xì)胞功能如質(zhì)子分泌、離子吸收、生長(zhǎng)控制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原微生物的防御反應(yīng)等生理功能密切相關(guān)[30]。細(xì)胞跨膜質(zhì)子流動(dòng)在細(xì)胞生長(zhǎng)、離子跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞pH穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等重要生理活動(dòng)中均發(fā)揮著重要作用。

膜結(jié)合氫化酶(membrane-bound hydrogenase, MBH)存在于許多微生物中，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinabarkeri)等[14，31]，但高等生物的細(xì)胞膜還沒有代謝氫氣的報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)純化的植物質(zhì)膜囊泡能夠產(chǎn)生氫氣，并且氫氣明顯影響質(zhì)膜上NADH-鐵氰化鉀氧化還原酶的活性，進(jìn)一步利用非損傷微測(cè)技術(shù)(non-invasive micro-test technique,NMT)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氫氣能夠顯著影響細(xì)胞表面的質(zhì)子泵出，以及鈉、鉀等離子的流動(dòng)[32]。

細(xì)胞膜內(nèi)外電荷差異在各種細(xì)胞上具有極其重要的生理功能，神經(jīng)細(xì)胞是研究細(xì)胞膜電位最佳的選擇。本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步采用膜片鉗技術(shù)測(cè)定氫氣對(duì)活體腦片動(dòng)作電位的影響，循環(huán)緩沖液等氣 體流速通入二氧化碳、氧氣、氫氣混合氣30 min確保飽和，測(cè)試過程中持續(xù)通入；使用膜片鉗在全細(xì)胞模式下記錄大腦皮層動(dòng)作電位(AP)。結(jié)果顯示氫氣組與對(duì)照組相比大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的靜息膜電位和動(dòng)作電位閾值發(fā)生改變，氫氣處理組靜息膜電位差升高(圖5A)，神經(jīng)細(xì)胞爆發(fā)動(dòng)作電位閾值升高(圖5B)，表明氫氣可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道的開放和關(guān)閉有影響(未發(fā)表數(shù)據(jù))。有研究表明氫水能減少小鼠嗎啡成癮戒斷癥狀，減少戒毒痛苦[33]；Mizuno等[34]的研究顯示氫水能夠降低焦慮、抑郁和神經(jīng)自主功能，對(duì)神經(jīng)興奮具有一定的抑制作用，此外也有氫氣改善睡眠的報(bào)道。結(jié)合本團(tuán)隊(duì)上述腦片膜片鉗結(jié)果所顯示的氫氣可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞膜電位，推測(cè)氫可能影響神經(jīng)細(xì)胞的興奮傳導(dǎo)功能，這可能是氫氣發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)。

以上這些結(jié)果進(jìn)一步證明細(xì)胞膜的氫代謝是氫氣可能的靶點(diǎn)之一，這為拓展氫氣的研究靶點(diǎn)提供了參考。

A：靜息條件下神經(jīng)細(xì)胞膜電位; B:外加電壓刺激下神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位閾值

4 展望

氫分子具有重要的生理功能。氫與羥自由基的直接反應(yīng)可能不是其發(fā)揮生物學(xué)功能的主要方面；我們不否認(rèn)氫具有抗氧化的作用，但氫氣的抗氧化作用屬于在自由基產(chǎn)生的源頭進(jìn)行控制；酶的活性中心具有特殊的微環(huán)境和高反應(yīng)活性，是氫分子作用的關(guān)鍵點(diǎn)，包括線粒體膜的氧化還原酶類特別是復(fù)合物Ⅰ、細(xì)胞膜的氧化還原酶類及離子通道等都受到氫氣的調(diào)節(jié)，這表明氫氣的作用可能是多靶點(diǎn)且主要基于酶學(xué)反應(yīng)的過程。氫氣作為能源其反應(yīng)產(chǎn)物是水，是屬于未來的清潔能源；氫氣在生物體內(nèi)最終的代謝歸宿也是水，這區(qū)別于所有的藥物，它同樣是屬于未來的可能改變?nèi)祟惤】的Ｊ降臍怏w。