黃春蒙, 朱鵬宇, 王智, 王晨光, 杜智欣, 魏霜, 張永江, 付偉*

1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京100176；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京100193；

3.南寧海關(guān)技術(shù)中心, 南寧 530029；

4.廣州海關(guān)技術(shù)中心, 廣州 510623

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，生物領(lǐng)域發(fā)展十分迅速，然而，我們?nèi)匀幻媾R著許多復(fù)雜的挑戰(zhàn)，其中包括在保持環(huán)境質(zhì)量的同時(shí)保障人口迅速增長(zhǎng)所帶來(lái)的對(duì)糧食的需求。這不僅需要最大程度減少作物病蟲(chóng)害，也需要利用現(xiàn)代生物技術(shù)改進(jìn)現(xiàn)有植物特性，特別是提高作物產(chǎn)量和抗逆性以適應(yīng)氣候變化。滿(mǎn)足這些需求離不開(kāi)包括RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯技術(shù)以及合成生物學(xué)技術(shù)[1]。RNAi轉(zhuǎn)基因植物是指基于RNAi技術(shù)，通過(guò)導(dǎo)入受體植物外源片段產(chǎn)生雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)并被加工成小RNA(small RNA，sRNA)，進(jìn)而引發(fā)與之互補(bǔ)的特定靶基因表達(dá)下降或沉默，從而獲得的可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或農(nóng)產(chǎn)品加工的植物及其產(chǎn)品。目前，國(guó)內(nèi)外研發(fā)人員已經(jīng)利用RNAi技術(shù)開(kāi)發(fā)出具備有害生物抗性、品質(zhì)改良、有害物質(zhì)減少等不同優(yōu)良性狀的生物技術(shù)產(chǎn)品。本文基于RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和作用原理，闡述了RNAi轉(zhuǎn)基因植物的設(shè)計(jì)、dsRNA或小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的遞送方式，并列舉了RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研究實(shí)例以及全球部分商業(yè)化的RNAi轉(zhuǎn)基因植物信息，旨在為RNAi技術(shù)的應(yīng)用提供參考，以期能夠充分利用RNAi技術(shù)助力發(fā)展高效綠色友好型農(nóng)業(yè)。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制

1.1 RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

RNA沉默是由小分子非編碼RNA(20～30 nt)引導(dǎo)的，包括多種沉默機(jī)制，如RNA降解、翻譯抑制、染色質(zhì)調(diào)控以及DNA缺失[2]，幾乎每個(gè)真核生物都存在某種形式的RNA沉默[3]。以siRNA和微小RNA(microRNA，miRNA)為主的各種類(lèi)型的小RNA分子已得到鑒定并被證明參與了真核生物復(fù)雜的生命活動(dòng)調(diào)控。如自然產(chǎn)生的反義RNA(antisense RNA)被發(fā)現(xiàn)參與了原核生物的DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)控[4]，反義RNA通過(guò)與靶向mRNA雜交來(lái)抑制內(nèi)源基因，由此產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙細(xì)胞核的加工、細(xì)胞質(zhì)輸出，導(dǎo)致翻譯抑制，進(jìn)而使靶基因的mRNA快速降解[5]。而且，共抑制表達(dá)的正義RNA(sense RNA)與反義RNA一樣，對(duì)靶基因同樣具有抑制作用[6]。此外，在一個(gè)位點(diǎn)上的多拷貝轉(zhuǎn)基因有可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)?！爱惓NA”的概念被引入作為RNA過(guò)豐度的結(jié)果，這些異常轉(zhuǎn)錄物可以用作引物，通過(guò)植物編碼的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)來(lái)轉(zhuǎn)化RNA或反義RNA，最終導(dǎo)致RNA降解[7]。這個(gè)概念同樣適用于轉(zhuǎn)基因重復(fù)序列易引發(fā)基因沉默的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因重復(fù)序列無(wú)論轉(zhuǎn)錄程度高低，都會(huì)直接導(dǎo)致RNA產(chǎn)物的異常從而觸發(fā)RNA過(guò)豐度途徑，因?yàn)檗D(zhuǎn)移DNA(transfer DNA，T-DNA)的插入往往導(dǎo)致直接重復(fù)(direct repeat，DR)或者倒置重復(fù)(inverted repeat，IR)，而早期在馬鈴薯和矮牽?；ㄖ械难芯勘砻鬓D(zhuǎn)基因低水平的表達(dá)與倒置重復(fù)緊密相關(guān)[8]。

同時(shí)，轉(zhuǎn)基因重復(fù)也被認(rèn)為涉及轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)。然而，這個(gè)過(guò)程需要內(nèi)源性RdRp的存在，第一種植物編碼RdRp在番茄中被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)其在核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)Ⅲ家族的Dicer酶或Dicer類(lèi)似蛋白(Dicer like protein，DCL)作用下的產(chǎn)物是一種新的短單鏈RNA，被稱(chēng)為siRNAs[9]。siRNA在dsRNA和同源RNA的引導(dǎo)降解之間提供了聯(lián)系。其實(shí)早在1991年，Cameron和Jennings[10]在觀察到動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的同源轉(zhuǎn)基因可使轉(zhuǎn)基因發(fā)生沉默后，便提出dsRNA可能參與同源性基因沉默的設(shè)想。1998年，F(xiàn)ire等[11]在研究秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)時(shí)首次證明dsRNA是基因沉默的最主要的誘發(fā)因子，推測(cè)在植物中也存在類(lèi)似機(jī)制，并將這種由dsRNA引發(fā)的抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象稱(chēng)為RNAi。

除了這種典型的RNAi機(jī)制，還存在由動(dòng)植物自身產(chǎn)生的miRNA調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象。1993年，研究者首次在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)miRNA途徑，并在2000年被鑒定為L(zhǎng)et-7miRNA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種保守途徑在線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中均存在[12]，主要通過(guò)翻譯抑制和/或降解同源mRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。2001年首次報(bào)道了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中采用RNAi技術(shù)抑制內(nèi)源基因表達(dá)[13]，進(jìn)一步發(fā)展了RNAi技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域和方向，隨后RNAi技術(shù)逐步應(yīng)用于疾病治療、基因功能研究和植物育種等領(lǐng)域。

1.2 RNAi的作用機(jī)制

在植物中，RNA沉默是一種抵御病毒、轉(zhuǎn)座子和重復(fù)基因組等核酸入侵的防御機(jī)制，通常在轉(zhuǎn)錄后水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯起始水平調(diào)控基因表達(dá)。RNAi的核心機(jī)制分為3個(gè)階段(圖1)：RNase Ⅲ Dicer酶將長(zhǎng)dsRNA切割為siRNA雙鏈體；選擇siRNA雙鏈體中的1條鏈，并將其裝載到一種由Argonaute蛋白(AGO)組成的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)；siRNA引導(dǎo)RISC識(shí)別并切割同源mRNA[14]。在某些物種中，RNAi還涉及RdRp，RdRp可以利用異常RNA或同源mRNA合成dsRNA，進(jìn)一步參與到RNAi次級(jí)沉默信號(hào)擴(kuò)大過(guò)程中[14]。

圖1 RNAi機(jī)制示意圖[14]

PTGS途徑常常由轉(zhuǎn)基因或病毒入侵引起，稱(chēng)為外源RNA沉默途徑，分為倒置重復(fù)途徑(IR-PTGS)和正義途徑(S-PTGS)。IR-PTGS途徑首先形成IR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物dsRNA，DCL4將dsRNA加工成21 nt的siRNA，經(jīng)3′端甲基化轉(zhuǎn)移酶HEN1甲基化修飾[15]，裝載到AGO蛋白形成RISC，在引導(dǎo)鏈RNA的引導(dǎo)下對(duì)同源mRNA進(jìn)行切割降解。而S-PTGS途徑主要負(fù)責(zé)異常RNA的降解。異常RNA分子通常缺少3′端polyA尾巴或5′端帽子，它們被認(rèn)為是來(lái)源于高豐度的轉(zhuǎn)基因正義/反義RNA、病毒RNA、截短型轉(zhuǎn)錄本以及復(fù)雜的基因插入、基因重復(fù)區(qū)域等。

TGS途徑與PTGS途徑具有共同的作用底物，并且都是通過(guò)靶向同源mRNA導(dǎo)致DNA甲基化，最終阻礙DNA轉(zhuǎn)錄。RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)實(shí)際上是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的由sRNA控制的表觀遺傳機(jī)制。RdDM最初是在煙草植物中發(fā)現(xiàn)的，在存在病毒自主以RNA為模板進(jìn)行RNA復(fù)制的情況下，其RNA被反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并整合到基因組中的類(lèi)病毒cDNA被特異性甲基化[16]。研究表明，與啟動(dòng)子區(qū)域互補(bǔ)的dsRNA可以誘導(dǎo)啟動(dòng)子甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默[17]。RdDM由不同類(lèi)型的序列誘導(dǎo)，有不同的靶標(biāo)，常利用2種類(lèi)型的dsRNA作為甲基化誘導(dǎo)物：具有反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)和dsRNA病毒[18]。RdDM不僅是控制重復(fù)序列和病毒入侵的響應(yīng)機(jī)制，也是調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一部分。

除了siRNA所引起的RNA沉默現(xiàn)象，miRNA介導(dǎo)AGO1進(jìn)行的靶基因切割也是一種重要的功能基因沉默模式，這在AGO1突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中得到了證明。類(lèi)似于其他真核生物，在miRNA的引導(dǎo)下，AGO1從mRNA堿基配對(duì)序列的中間進(jìn)行切割[19]，使被切割的mRNA暴露1個(gè)游離的5′端片段和1個(gè)3′羥基，再?gòu)?′端片段引發(fā)裂解，切割片段由末端尿苷酸轉(zhuǎn)移酶HESO1在3′端對(duì)其進(jìn)行尿?；?，最終降解。

植物的miRNA-靶基因相互作用并不總是導(dǎo)致AGO切割，也有可能導(dǎo)致翻譯抑制。目前對(duì)植物miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制的分子機(jī)制的研究程度不如動(dòng)物，但是二者存在相似之處。除2種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式外，植物miRNA也可以進(jìn)入到RdDM機(jī)制中。在這種情況下，miRNA前體將由DCL 3處理產(chǎn)生較長(zhǎng)的片段(24 nt)，并被裝載到AGO4/6/9系統(tǒng)以引導(dǎo)DNA序列發(fā)生甲基化修飾，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)[20]。目前已在水稻中發(fā)現(xiàn)了這類(lèi)miRNA的具體實(shí)例，其中有一類(lèi)miRNAs由DCL3處理，裝載到AGO4上引導(dǎo)DNA甲基化[21]。

2 RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)現(xiàn)狀

RNAi技術(shù)應(yīng)用于植物育種多采用外源導(dǎo)入T-DNA的方式，將正義RNA、反義RNA或者倒置重復(fù)的靶基因序列放置于選定的啟動(dòng)子下形成dsRNA，并進(jìn)一步加工成siRNA進(jìn)入RNAi途徑以調(diào)控植物發(fā)育，從而達(dá)到育種目的。此外，也有人工miRNA的途徑和利用RdDM的途徑，后者能夠?qū)Π谢虻膯?dòng)子進(jìn)行表觀遺傳修飾從而調(diào)控靶基因表達(dá)以改變植物農(nóng)藝性狀。本文從轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)、sRNA遞送方式、RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研究實(shí)例3個(gè)角度來(lái)闡述RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)現(xiàn)狀。

2.1 RNAi轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)

2.1.1正義或反義RNA 通過(guò)共表達(dá)mRNA靶標(biāo)的正義和反義轉(zhuǎn)錄本，引入用于植物沉默的轉(zhuǎn)基因dsRNA。該方法依賴(lài)于由2個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)RNA雜交獲得的用于RNA沉默的dsRNA。盡管與單獨(dú)使用反義轉(zhuǎn)錄物相比，該方法的效率并未顯著提高，且遠(yuǎn)小于使用IR的方法[22]。但是，正義和反義轉(zhuǎn)錄本可以在相反的啟動(dòng)子之間進(jìn)行聚合轉(zhuǎn)錄，這種設(shè)計(jì)縮短了所需的T-DNA的長(zhǎng)度，并避免重復(fù)使用序列。通過(guò)錐蟲(chóng)和果蠅的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了存在通過(guò)聚合轉(zhuǎn)錄的RNAi介導(dǎo)的基因抑制[23]。

2.1.2內(nèi)含子嵌入的倒置重復(fù)序列 有時(shí)為了獲得理想的表型，將內(nèi)含子整合進(jìn)反向重復(fù)區(qū)域作為一個(gè)保守的調(diào)控元件來(lái)保證基因時(shí)空特異性的表達(dá)和抑制。最常用的RNA沉默轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)是包含1個(gè)由間隔序列分隔的倒置重復(fù)IR序列。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄IR序列形成dsRNA并被加工成為成熟siRNA以有效地沉默靶基因。間隔序列可以是與靶標(biāo)無(wú)關(guān)的任何序列，使用內(nèi)含子衍生的可插入間隔可以增加沉默效率[24]。除了植物，基因內(nèi)含子衍生的人工短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)也能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默[25]。有時(shí)在育種中追求更加理想的表型性狀，會(huì)在表達(dá)一個(gè)基因的同時(shí)抑制另一個(gè)基因的表達(dá)。在高賴(lài)氨酸表型的基因工程玉米中，表達(dá)賴(lài)氨酸反饋不敏感的生物合成酶CordapA而抑制內(nèi)源賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(lysine ketoglutarate reductase/yeastine dehydrogenase，LKR/SDH)累積可以最大程度地提高成熟籽粒中游離賴(lài)氨酸的積累，從而獲得高賴(lài)氨酸含量的玉米品種[26]，在這個(gè)高賴(lài)氨酸含量的玉米中，抑制內(nèi)源基因的設(shè)計(jì)則是采用插入內(nèi)含子的倒置重復(fù)序列。

2.1.3人工miRNA 內(nèi)源性miRNA序列可以被設(shè)計(jì)成人工miRNA(artificial miRNA，AmiRNA)。AmiRNA首次被報(bào)道是在人的細(xì)胞系中，內(nèi)源性miRNA前體經(jīng)修飾產(chǎn)生AmiRNA，從而選擇性抑制互補(bǔ)靶序列[27]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，盡管RNAi已經(jīng)被證明是有效的，但dsRNA用于RNA沉默的途徑是有限的。除少數(shù)胚胎細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)外，dsRNA還可誘導(dǎo)翻譯抑制[28]。因此，由動(dòng)物miRNA前體產(chǎn)生的shRNAs常被用于沉默動(dòng)物系統(tǒng)中的內(nèi)源性基因[29]?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)給出使sRNA有效的發(fā)揮RNA沉默作用的途徑和原則：在動(dòng)物miRNAs中，來(lái)自5′端的第2～8位(種子區(qū))的核苷酸位置可能是靶特異性的最重要的決定因素[30]；sRNA雙鏈中更傾向于將5′端處于不穩(wěn)定狀態(tài)的鏈裝載到RISC[31]；GC含量在30%～50%為佳[32]；具有5-尿苷的sRNA可優(yōu)先裝載到AGO1[33]。同樣地，miRNAs也能抑制報(bào)告基因和內(nèi)源性基因在植物中的表達(dá)[34]。有學(xué)者基于以上原則，開(kāi)發(fā)了一個(gè)用于設(shè)計(jì)miRNAs的平臺(tái)，稱(chēng)為Web microRNA設(shè)計(jì)器(WMD)[35]。這個(gè)工具考慮到植物基因組序列信息，允許自動(dòng)優(yōu)化sRNA特性，以便有效地沉默靶基因，同時(shí)保持miRNAs在30多種植物中的靶向特異性。不像動(dòng)物AmiRNA那樣需要與靶基因完美配對(duì)，在設(shè)計(jì)植物AmiRNA時(shí)，需要考慮加入錯(cuò)配以避免產(chǎn)生siRNA沉默的移動(dòng)性。已有研究表明可利用單個(gè)反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因敲除多個(gè)基因[36]，同樣地，將多個(gè)AmiRNA前體組合成轉(zhuǎn)基因可以沉默多個(gè)靶基因。

2.1.4RdDM途徑 農(nóng)桿菌對(duì)瞬時(shí)表達(dá)基因的滲透、轉(zhuǎn)基因砧木嫁接、反向育種和RdDM被歸類(lèi)為新植物育種技術(shù)(new plant breeding techniques，NPBTs)[37]。其中，RdDM方法可以在不改變基因組序列的情況下，通過(guò)轉(zhuǎn)錄基因沉默或啟動(dòng)子甲基化來(lái)修飾基因表達(dá)。甲基化可以由dsRNA誘導(dǎo)，該dsRNA需經(jīng)RdDM介導(dǎo)的各種宿主酶處理，包括聚合酶Ⅳ和Ⅴ、AGO蛋白和胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶[38]；同時(shí)，siRNAs也可在靶DNA區(qū)誘導(dǎo)特定胞嘧啶殘基(CG、CHG和CHH，其中H為A、C或T)的甲基化，導(dǎo)致TGS[39]，這種改變可以穩(wěn)定遺傳數(shù)代。目的基因的TGS也可以通過(guò)人工導(dǎo)入與其啟動(dòng)子區(qū)域相對(duì)應(yīng)的dsRNA來(lái)獲得，這些表觀遺傳變化均可遺傳。還有少數(shù)研究報(bào)道了由RdDM介導(dǎo)的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默，如在CaMV35S啟動(dòng)子控制下的綠色熒光蛋白(gteen fluorescent protein，GFP)基因[40]或水稻中的葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase，GUS)基因。此外，為了誘導(dǎo)水稻(OryzasativaL.)內(nèi)源基因的TGS，Wakasa等[41]表達(dá)了不同啟動(dòng)子區(qū)域的dsRNA，從而誘導(dǎo)了RdDM，將來(lái)自谷蛋白多基因家族的GluB4基因作為靶標(biāo)，與PTGS相比，TGS對(duì)靶標(biāo)基因表現(xiàn)出特異性抑制。

2.2 sRNA遞送方式

siRNA或dsRNA如何有效進(jìn)入植物受體并針對(duì)靶基因發(fā)揮作用對(duì)于育種和基因功能研究十分關(guān)鍵。已經(jīng)報(bào)道的技術(shù)手段是將合成的dsRNAs或siRNAs直接外源應(yīng)用于植物表面，如直接噴霧、機(jī)械接種、高壓噴涂以及采用促進(jìn)RNA粘附的材料；也可采用間接方式，如納米載入、蛋白質(zhì)載體、病毒載入、T-DNA插入基因組等[42-44]。

目前采用最多的方式是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，如采用T-DNA插入、基因槍轟擊將外源片段整合到植物基因組。已有研究報(bào)道了在擬南芥、矮牽牛花、番茄、馬鈴薯和煙草中均可利用T-DNA表達(dá)相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)域的dsRNA從而誘導(dǎo)內(nèi)源性基因的TGS[45-47]。

對(duì)于植物識(shí)別和吸收細(xì)胞外核酸的機(jī)制的研究是近年來(lái)才開(kāi)始的。孟山都公司(現(xiàn)已并購(gòu)入拜耳)的研究人員通過(guò)噴灑多核苷酸分子來(lái)改造轉(zhuǎn)基因植物[48]，研究表明，dsRNAs、siRNAs甚至單鏈DNA都能有效地促進(jìn)植物的局部和系統(tǒng)沉默。與之類(lèi)似的方法包括通過(guò)轉(zhuǎn)入細(xì)菌表達(dá)dsRNAs的提取物[49]或含有載體肽的合成dsRNAs提取物[50]來(lái)沉默靶基因。除了dsRNAs，siRNAs也被采用納秒脈沖激光誘導(dǎo)遞送到細(xì)胞中[51]或與聚合物納米粒子結(jié)合產(chǎn)生原生質(zhì)體[52]以進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。除孟山都公司在植物上直接應(yīng)用siRNAs實(shí)現(xiàn)局部和全身性沉默外，Numata等[53]的研究表明，在含有蛋白質(zhì)載體的復(fù)合物中噴灑合成的siRNAs可能會(huì)導(dǎo)致局部花青素的喪失，這可能是查爾酮合成酶基因沉默所致。將合成的GFP-siRNA溶液，在高壓下通過(guò)常規(guī)壓縮機(jī)和氣刷手槍噴涂在GFP轉(zhuǎn)基因煙草表面，可以沉默GFP基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因煙草無(wú)熒光；在不施加高壓的情況下，未觀察到這種效果[54]。Numata等[53]將在體外合成的黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)-siRNA與載體肽復(fù)合物滲透到楊樹(shù)的葉片中，利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YFP蛋白水平和熒光程度均降低。更簡(jiǎn)單的操作是利用軟毛刷導(dǎo)入外源dsRNA，可以抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥中的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(neomycin phosphotransferase，NPT Ⅱ)和GFP的轉(zhuǎn)錄水平[44]。上述研究表明，直接外源應(yīng)用dsRNA、siRNA可以便捷高效地引起局部或系統(tǒng)沉默，并且可檢測(cè)沉默效果。但是外源應(yīng)用dsRNA、siRNA存在吸收率低的現(xiàn)象，推測(cè)生物損傷是植物RNA攝取的關(guān)鍵[54]。相比之下，利用T-DNA插入、基因槍轟擊或病毒載入的方式更能引發(fā)穩(wěn)定高效的RNA沉默效應(yīng)，并且能夠穩(wěn)定遺傳。

2.3 RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研究實(shí)例

目前，RNAi已廣泛應(yīng)用于植物育種領(lǐng)域，并已經(jīng)研發(fā)出多種具有優(yōu)良性狀的作物，主要分為2大類(lèi)：賦予植物抗性和調(diào)控植物代謝。其中，賦予植物抗性分為：抗蟲(chóng)、抗病毒、抗真菌、抗線蟲(chóng)、抗寄生性雜草等；調(diào)控植物代謝分為：產(chǎn)量性狀改良、營(yíng)養(yǎng)改良、消除過(guò)敏原等。在已有的RNAi技術(shù)中，抗蟲(chóng)作物的靶標(biāo)包括西方玉米根蟲(chóng)(Diabroticavirgiferavirgifera)、南部玉米根蟲(chóng)(Diabroticaundecimpunctatahowardii)、科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsadecemlineata)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)等[55]；抗真菌的靶標(biāo)有致病疫霉(Phytophthorainfestans)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.Cubense)和鐮刀菌屬(Fusariumsp.)[56-57]；抗線蟲(chóng)的靶標(biāo)為孢囊線蟲(chóng)、根結(jié)線蟲(chóng)、根腐線蟲(chóng)[58-60]。此外，抗病毒的作物有甜菜壞死黃脈病毒抗性煙草、馬鈴薯Y病毒抗性馬鈴薯、番茄黃化曲葉病毒抗性番茄、水稻東格魯病毒抗性水稻、柑桔衰退病毒抗性墨西哥酸橙、馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒抗性番茄[61]；寄生雜草抗性的作物有抗獨(dú)腳金雜草的轉(zhuǎn)基因玉米[62]。產(chǎn)量性狀改良的成功案例包括纖維品質(zhì)優(yōu)良的早熟豐產(chǎn)旱地品種棉花、種子含油量增加的擬南芥和麻風(fēng)樹(shù)、木質(zhì)素含量降低的玉米[63-64]。營(yíng)養(yǎng)改良的研究涉及同時(shí)增加類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)黃酮含量的番茄、α-亞麻酸含量降低的大豆、β-胡蘿卜素含量增加的柑桔、賴(lài)氨酸含量提高的玉米、油酸含量增加的花生、顏色改變的文心蘭[65-67]；消除過(guò)敏原的實(shí)例主要是沉默蘋(píng)果中的Mald1、花生中的ARAH2、木質(zhì)素中的P450、洋蔥中的LFS、咖啡中的CaMXMT、煙草中的CYP82E4、番茄中的LeETR4和ACC、花生中的Arah2以及“無(wú)淚”洋蔥中的黑麥因子合成酶基因[68]。此外，還有應(yīng)用于醫(yī)藥的實(shí)例——利用RNAi技術(shù)生產(chǎn)抗乙肝病毒的生菜[69]。

國(guó)內(nèi)外RNAi植物的研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足發(fā)展，目前已經(jīng)獲得商業(yè)化批準(zhǔn)、可用作食用或者加工原料的RNAi轉(zhuǎn)基因植物的信息如表1所示。

表1 商業(yè)化應(yīng)用的RNAi轉(zhuǎn)基因植物

數(shù)據(jù)來(lái)源：歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)；美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture，USDA)；國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)。

3 展望

RNAi技術(shù)作為2001年的十大科學(xué)成就之一，Science雜志在2002年又將其列為十大科學(xué)成就之首。同年，Nature雜志也將sRNA評(píng)選為重大科技成果之一。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于植物改良通常旨在減少害蟲(chóng)數(shù)量、提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)、降低種植成本、減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，以期助力于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。與基因編輯技術(shù)相比，RNAi技術(shù)也具有自身的不可替代性，RNAi技術(shù)能夠克服物種的基因冗余和多倍性，允許一個(gè)基因家族的單個(gè)或多個(gè)成員或同源基因拷貝的沉默，如小麥和香蕉[70-71]；RNAi抗蟲(chóng)作物的優(yōu)點(diǎn)之一是幾乎能夠靶向任何基因，但是常規(guī)的轉(zhuǎn)基因作物可能并沒(méi)有商業(yè)化的殺蟲(chóng)蛋白可用；RNAi技術(shù)還可以提供廣譜抗性。隨著測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，RNAi技術(shù)不僅可以利用轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，也可以利用RdDM對(duì)基因組進(jìn)行表觀遺傳修飾，給植物功能和育種研究帶來(lái)了更多選擇。而RNAi技術(shù)與合成生物學(xué)相結(jié)合可以更好地控制植物特定生長(zhǎng)途徑的代謝過(guò)程，能夠達(dá)到精準(zhǔn)改良育種的目的。值得注意的是，雖然RNAi技術(shù)在生物安全性方面的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[72]，但相關(guān)機(jī)制尚未明確，RNAi技術(shù)在作物改良中的應(yīng)用潛力有待于進(jìn)一步挖掘。