王澤洲，陳弟詩，張毅，吳俊清，章健，賀冬梅

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（PRV）引起的一種傳染病，妊娠母豬發(fā)病后可發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎；哺乳豬和保育豬發(fā)病后，可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和呼吸道癥狀，感染豬日齡越大死亡率越低；育肥豬和成年豬發(fā)病后，可出現(xiàn)發(fā)熱和呼吸道癥狀，耐過豬可終身帶毒，成為病原貯存宿主。我國自1947 年首次報(bào)道豬感染偽狂犬病毒以來，已有20 多個(gè)省市相繼發(fā)生過本病，豬群的平均陽性率達(dá)20%以上［1］。豬偽狂犬病防控和凈化的核心技術(shù)是基因缺失（標(biāo)記）疫苗和鑒別診斷方法的研究和應(yīng)用。目前我國豬場中使用的基因缺失疫苗有Bartha 株、HB98 株、SA215 株和BUK株。偽狂犬病毒野毒抗體的檢測常使用gEELISA試劑盒，免疫抗體的檢測常使用gB-ELISA試劑盒和滅活全病毒抗原的ELISA 試劑盒。由于ELISA 抗體和免疫保護(hù)力關(guān)系不強(qiáng)，用膠體金法檢測抗體又存在敏感性不高，憑肉眼觀察存在主觀臆斷、準(zhǔn)確性低等問題，因此，本研究應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物研制了一種既具有金標(biāo)層析技術(shù)簡單、方便、快捷，又具有ELISA 準(zhǔn)確、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)的豬偽狂犬病抗體鑭系熒光免疫層析快檢試劑盒（PRV-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 PRV-gE 和PRV-gB 表達(dá)蛋白抗原、兔抗雞IgY 抗體、雞IgY 抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608 熒光儀，吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機(jī)、點(diǎn)膜和噴金膜機(jī)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的陽性血清，豬偽狂犬病毒gB 抗體ELISA 檢測試劑盒，豬偽狂犬病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒。

此外，制備包被膜、抗原標(biāo)記微球、夾心法建立等均參照說明書或按相關(guān)要求操作。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環(huán)境下，把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異性試驗(yàn) 以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線）與CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、PEDV、TGEV的陽性血清進(jìn)行豬偽狂犬病抗體鑭系熒光免疫層析檢測，同時(shí)設(shè)豬偽狂犬病毒血清陽性和陰性對照，以確定該試驗(yàn)方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4 敏感性試驗(yàn) 將PRV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按1∶40、1∶160、1∶640、1∶2 560、1∶10 240、1∶40 960 倍比稀釋，每個(gè)稀釋度平行做4個(gè)重復(fù)，用上述組裝好的PRV-LFICA 試劑卡檢測，將結(jié)果換算成T∕C值，判斷抗體檢出效價(jià)。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

1.5.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份PRV 抗體水平不同的血清，每份樣本平行做8個(gè)重復(fù)，用組裝的PRV-LFICA 試劑卡檢測（批號為20170831），然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份PRV 抗體水平不同的血清，分別用4 批PRVLFICA 試劑卡檢測（批號分別為20180717、20181023、20181211、20190216），然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 比較試驗(yàn) 分別取豬偽狂犬病毒gB抗體高敏熒光免疫層析法試劑卡和豬偽狂犬病毒gB 抗體ELISA檢測試劑盒，同時(shí)檢測臨床樣品200份，操作方法與結(jié)果判定按說明書進(jìn)行。再分別取豬偽狂犬病毒gE 抗體高敏熒光免疫層析法試劑卡和豬偽狂犬病毒gE 抗體ELISA 檢測試劑盒，同時(shí)檢測臨床樣品200份，操作方法與結(jié)果判定也按說明書進(jìn)行。

1.7 試劑盒的組裝及保存期試驗(yàn) PRV-LFICA 試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PRV-LFICA的各個(gè)優(yōu)化條件，對PRV 陽性和陰性參考血清進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 應(yīng)用試驗(yàn) 應(yīng)用本次研制的PRV-LFICA試劑盒檢測收集自四川省內(nèi)各地的1782份樣本，了解PRV血清抗體陽性率。

2 結(jié)果

2.1 測定條件的選擇 按照鑭系熒光免疫層析法的操作步驟，選擇標(biāo)記量比例為1∶25的免疫微球；以樣本稀釋倍數(shù)40 倍為加樣量；檢測時(shí)間選擇為加樣后15 min。

2.2 檢測結(jié)果的判讀 加樣后，由于層析作用液體向前移動(dòng)，先后與包被在T 線和C 線上的抗原形成復(fù)合物，這時(shí)試紙條經(jīng)熒光檢測設(shè)備掃描顯示出2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應(yīng)的檢測結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，熒光值信號為縱坐標(biāo)，經(jīng)對數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理程序擬合即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣本為陰性時(shí)，PRV抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測不到；當(dāng)樣本為陽性時(shí)，PRV 抗體濃度越高，T 線熒光值也越高。無論結(jié)果是陽性還是陰性，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現(xiàn)，無論T線有無，結(jié)果均判為無效。

2.3 特異性試驗(yàn) 本次用PRV-gE和PRV-gB蛋白分別建立的PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 試劑盒檢測7 種常見豬病的陽性血清，得到的熒光比值均低于0.35（表1、表2），呈陰性反應(yīng)。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 試劑盒與7 種常見豬病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，PRV-gE-LFICA 試劑盒對gB陽性血清，PRVgB-LFICA試劑盒對gE陽性血清也不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的特異性。

表1 PRV-gE交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

表2 PRV-gB交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn) 把PRVgB 和PRV-gE 標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清稀釋至2 560 倍，鑭系熒光檢測結(jié)果仍為陽性。用同一份陽性血清分別同時(shí)做ELISA 和PRV-gB-LFICA、PRV-gE-LFICA檢測，結(jié)果顯示：PRV-gB-LFICA、PRVgE-LFICA 比ELISA 檢 測 結(jié)果高1～2個(gè)滴度。表明該方法敏感性很好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%（表3、表4），批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)也均小于10%（表5、表6）。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 試劑盒具有良好的重復(fù)性。

表3 PRV-gB-LFICA批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 PRV-gE-LFICA批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 PRV-gB-LFICA批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表6 PRV-gE-LFICA批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 比較試驗(yàn) 用PRVgB-LFICA試劑盒和gB-ELISA試劑盒同時(shí)檢測臨床樣品200 份，其中PRV-gB-LFICA檢出陽性139 份，陰性48 份，可疑13 份；gB-ELISA 檢出陰性47 份，陽性152份，可疑1 份。兩種檢測方法的總符合率為89%（表7）。

用PRV-gE-LFICA 和gE-ELISA 試劑盒同時(shí)檢測臨床樣品200 份，其中PRV-gE-LFICA 檢出陽性13 份，陰性187 份；gE-ELISA 檢出陰性188份，陽性12 份。兩種檢測方法的總符合率為97.5%（表8）。

表7 gB-ELISA和PRV-gB-LFICA試劑盒檢測200份臨床樣品的結(jié)果

表8 gE-ELISA和PRV-gE-LFICA試劑盒檢測200份臨床樣品的結(jié)果

2.7 保存期試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明（表9、表10），PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 試劑盒在保存480 d 后檢測陽性血清、陰性血清，T∕C 值的變異系數(shù)均小于10%，說明該試劑盒在保存12個(gè)月后仍然穩(wěn)定有效，進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

表9 PRV-gB-LFICA保存期試驗(yàn)結(jié)果

表10 PRV-gE-LFICA保存期試驗(yàn)結(jié)果

2.8 現(xiàn)場應(yīng)用試驗(yàn) 使用本次研制的PRV-gELFICA和PRV-gB-LFICA試劑盒檢測收集自四川省內(nèi)各地的樣本1 782 份，結(jié)果檢出血清gB 抗體陽性1 551 份，免疫抗體陽性率為87.0%；檢出血清gE抗體陽性39份，野毒抗體陽性率為2.19%。

3 討論

3.1 本研究采用鑭系元素銪（Eu）作為熒光物質(zhì)，與傳統(tǒng)熒光物質(zhì)相比，銪具有獨(dú)特的熒光光譜特性：Stokes位移大，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，熒光壽命很長［2-3］。由此建立的熒光方法特異性更強(qiáng)、敏感性更高，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。熒光納米微球的大小和均勻度也是影響快檢試劑盒檢測效果的重要因素，本試驗(yàn)用的微球粒徑為70～200 nm。微球表面經(jīng)過羧基（或氨基）活化處理，易與蛋白或抗體共價(jià)偶聯(lián)，能牢固地結(jié)合，提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)的包被量，從而大大提高標(biāo)記效率和靈敏度。

3.2 在豬偽狂犬病常用檢測方法中，病毒分離鑒定與中和試驗(yàn)是經(jīng)典方法，但由于涉及細(xì)胞繁殖、病毒培養(yǎng)、染色標(biāo)記等復(fù)雜操作，加之檢測周期長，對實(shí)驗(yàn)儀器和操作人員技術(shù)水平的要求也較高，故很難在基層和普通實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。ELISA 是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測技術(shù)，是目前檢測動(dòng)物疫病抗體的主要方法。所有的ELISA 都具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完整的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)，檢測一批樣品的整個(gè)流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫(yī)站和一般養(yǎng)殖場不適用。膠體金免疫層析法（GICA）是近年來發(fā)展起來的一種快速檢測方法，操作簡單，使用方便，不需要特殊儀器設(shè)備，肉眼直接觀察和判定結(jié)果，全程只需要幾分鐘，但敏感性、重復(fù)性不高，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，漏檢率和誤診率較高[4-5]。

本研究建立的PRV-LFICA 檢測方法，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡單方便、適于基層等優(yōu)點(diǎn)，通過專用設(shè)備檢查克服了主觀臆斷，采用鑭系元素作熒光標(biāo)記克服了產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定性；又具有ELISA敏感、特異、微量等優(yōu)點(diǎn)，克服了其缺點(diǎn)，檢測時(shí)間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員，檢測設(shè)備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場和技術(shù)服務(wù)人員。從PRV-LFICA 方法學(xué)評估可以知道，該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性都較好，與國內(nèi)ELISA 試劑盒檢測結(jié)果的符合率和敏感性都在90%以上，表明該方法完全可以用于PRV 免疫抗體的檢測和野毒抗體的監(jiān)測。