趙依杰 林麗霞 姚立萍 駱志堅 胡章瓊

摘要：研究利用ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標記技術對21份福州地區(qū)柑橘種質資源進行遺傳多樣性分析，以期為福州地區(qū)柑橘的品種鑒定及育種提供理論依據和技術支持。試驗從27條ISSR引物中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的14條引物，對供試材料進行遺傳多態(tài)性分析。獲得162條總條帶，其中多態(tài)性條帶129條，多態(tài)位點百分率為79.63%;聚類結果顯示21份資源可分為5個組，13份福橘被聚為同一組，進而可劃分為4個亞組。ISSR標記能較好地區(qū)分福州地區(qū)柑橘資源，且福州柑橘地方資源遺傳多樣性豐富。

關鍵詞：柑橘;種質資源;福州;ISSR分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號：S666.2

文獻標志碼：A

論文編號：cjas18080021

0引言

柑橘（Citrus reticulata）是蕓香科屬植物[1]，喜溫暖濕潤氣候。一般適合在12.5-37℃的溫度下生長發(fā)育，也與日照、水分、土壤以及海拔等環(huán)境條件緊密相關。柑橘栽培歷史悠久，色彩絢麗的柑橘全身都是寶，不僅有很高的食用價值而且還具有藥用及保健功效[2-3]。不過，與其他果樹相比，柑橘易發(fā)生種間雜交及與其近緣枳屬、金柑屬之間的雜交，還受到芽變、環(huán)境及栽培方式等影響，以致發(fā)生了遺傳變異而擁有眾多遺傳資源[4]。福州位于歐亞大陸東南邊緣，東臨太平洋，是典型的亞熱帶濕潤季風氣候，年平均降水量900-2100mm，年平均氣溫16-20℃，海拔多在600-1000m之間。因此，氣溫適宜和雨水充足的福州適合柑橘的廣泛種植及新品種的培育。但是，福州地區(qū)柑橘品種鑒定及其研發(fā)利用仍處于滯后階段，研究其種質資源遺傳多樣性對遺傳改良和優(yōu)異種質資源保護具有重要意義。目前，已有較多關于柑橘遺傳多樣性的研究報道，但鮮有針對福州地區(qū)柑橘資源的評價研究[5-7]。本研究利用ISSR分子標記技術對福州地區(qū)的部分柑橘種質資源進行遺傳多樣性及親緣關系評價，以期為福州地區(qū)柑橘種質資源的創(chuàng)新、研發(fā)利用及保護提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

21份柑橘種質資源采自福州市農業(yè)科學研究所柑橘種質資源圃（表1）。選取新生幼嫩、無病害葉片置于錫箔紙中，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗中所用試劑藥品均由北京全式金生物技術有限公司提供。

1.2DNA的提取與純化

選取健康幼嫩的柑橘葉片，參考改良過的CTAB-mini法[8]提取葉片基因組DNA，測定其純度，用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA，并用紫外分光光度計測定濃度與純度質量。最終將DNA稀釋到25ng/μL，于-20CC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ISSR反應條件建立及引物篩選

通過對基因組DNA濃度、TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTP、退火溫度等主要因素的調整、優(yōu)化，確定ISSR-PCR擴增反應總體積為20μL，PCR反應液含有的組分和終濃度為：DNA模板1μL（20ng/μL），引物1μL（10μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 10μL，ddH2O8μL。

實驗根據加拿大溫哥華哥倫比亞大學ISSR引物庫數(shù)據，查閱文獻選取27條引物，并委托福州尚亞生物技術有限公司合成。在引物篩選中，以隨機挑選的5個樣品的DNA為模版進行ISSR-PCR擴增，最終挑選出14條引物。

1.4ISSR擴增及產物檢測

擴增反應在PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，最適退火溫度下退火1min（退火溫度隨引物而定），72℃延伸1min，經過35個循環(huán)后，72℃延伸10min。

擴增產物檢測：以Trans2K Plus DNA Mark為分子量標記，在0.5xTBE緩沖液中，于2%瓊脂糖凝膠，90V電壓下電泳50min，用Britain GGM/D2凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.5統(tǒng)計學處理

對各居群ISSR-PCR產物的電泳圖譜進行判讀，每個電泳圖譜中同一擴增位點上有條帶記作“1”，無條帶記作“0”，得到由“1”和“0”組成的二元式數(shù)據矩陣[9]。運用NTSYS-pc2.1Oe軟件的Dice方法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進行聚類分析，建立聚類分析樹狀圖[10]。

2結果與分析

2.1引物篩選

從27條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態(tài)性高且重復性好的引物，編號依次為Z810、Z825、Z807、Z834、Z840、Z855、Z873、Z809、Z826、Z842、Z847、Z848、Z867、Z881，用于21個樣本的遺傳多樣性分析。圖1為引物對柑橘15個樣本總DNA進行ISSR擴增的瓊脂糖電泳圖譜。

2.2ISSR擴增結果

篩選的14條引物共擴增出清晰可重復的條帶162條，平均為11.57條，擴增產物主要介于250-3000bp，擴增條帶數(shù)最少和最多的引物分別是Z848、Z881，各擴增出7條和17條條帶。其中多態(tài)條帶129條，平均多態(tài)位點百分率占79.63%;多態(tài)性最低的引物是Z842，多態(tài)性為60%;多態(tài)性最高的引物是Z825，多態(tài)性高達100%。

2.3 21份福州地區(qū)柑橘的群體結構分析（基于距離聚類）

采用NTSYSpc2.le軟件根據Nei's遺傳一致度，利用非加權配對算數(shù)平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA），對供試的21份柑橘個體進行遺傳關系聚類，得到福州柑橘聚類樹狀圖（圖2）。如圖所示，當以遺傳相似系數(shù)0.72為閡值，可將供試的21份材料劃分為5組（A、B、C、D、E）。A組包含5份資源，在組中‘日輝、‘紅皮桔相聚，‘魯賓諾、‘托馬特拉相聚，再與‘秋輝聚類，說明‘日輝與‘紅皮桔親緣關系較近，‘魯賓諾與‘托馬特拉親緣關系較近。當以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，A組又可分為3個亞組，‘日輝與‘紅皮桔、‘魯賓諾與‘托馬特拉依然聚類為一組，而‘秋輝獨立一組，這說明‘秋輝與‘魯賓諾、‘托馬特拉的親緣關系相對較遠。B組包含13份資源，具體為‘閩清2號、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號、‘珠心胚1號、‘珠心胚2號、‘閩侯大義、‘江南橫槎、‘砂糖橘、‘蘆柑、‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔和‘日本桔，且這13份柑橘種質資源都為福橘并存在一定的親緣關系。當以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，可將B組資源分成為4個亞組。B1‘閩清2號、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號、‘珠心胚1號、‘珠心胚2號、‘閩侯大義、‘江南橫槎;B2‘砂糖橘、‘蘆柑;B3‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔;B4‘日本桔。說明亞組內各資源可能存在相對密切的親緣關系。C組為‘黃果柑單獨成組，為柑類;D組為‘黑納蒂娜單獨成組，為雜柑類;E組為‘桔柚單獨成組，為桔柚類。

3結論與討論

在柑橘親緣關系及遺傳多樣性分析方面，已采用RAPD、AFLP、SSR、ISSR等分子標記技術進行研究[5-7.11-15]。王三紅等[16]應用RAPD技術對臍橙品系和葡萄柚品系進行鑒別;謝讓金等[17]利用AFLP分子標記對真正柑橘果樹群6屬植物間以及柑橘屬各主要類型（種）的進化關系進行了詳細的討論;辜青青等[18]利用SSR標記技術對28份南豐柑橘資源進行基因組多態(tài)性分析，他們發(fā)現(xiàn)南豐廣橘品種群中‘蜜廣與南豐蜜橘品種群親緣關系較近，而‘紅廣與親本南豐蜜橘和‘紅橘的親緣關系均較遠;施維屬等[19]運用ISSR分子標記法發(fā)現(xiàn)24份甜橙種質資源間的親緣關系相對較近，并找到了鑒定不同品種的特異性標記。

ISSR既綜合了RFLP、RAPD及SSR等分子標記技術的各種優(yōu)點，又具有較高的多態(tài)性和穩(wěn)定性，無需預知物種DNA信息背景，操作簡單，成本低，廣泛應用于植物的遺傳多樣性研究[11.20-22]。因此，本研究采用ISSR分子標記技術，并通過篩選得到14對高效ISSR引物對21份樣品進行遺傳多樣性分析，共檢測到位點162個，多態(tài)率高達79.63%，多態(tài)性較高，表明供試柑橘基因組DNA具有明顯的遺傳差異，具有較高的遺傳多樣性。此次試驗所選的21份柑橘種質資源均采自福州地區(qū)，其中13份柑橘種質資源為福橘，意在探究福橘與其他引進品種之間的親緣關系，以便對地方特色柑橘種質資源進行更好地保護和遺傳改良。因柑橘葉片中富含酚類、單寧及多糖等干擾物質增加了基因組提取難度，施維屬等[8]采用液氮下研磨柑橘葉片進行DNA提取。傳統(tǒng)的酚-氯仿提取操作繁瑣且有毒，而本研究所用的磁珠法核酸提取技術操作簡單、毒性低且可多個樣品同時提取，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方式。

遺傳一致度是從相同的方向對供試的柑橘進行遺傳關系方面的分析，親緣關系越近的柑橘遺傳一致度系數(shù)越接近[23-25]。根據ISSR分子標記技術所產生的“1”、“0”矩陣數(shù)據，并利用NTSYSpc2.1軟件根據Nei's遺傳一致度，利用UPGMA法對福州21份柑橘種質資源進行聚類與分析，由圖2分析，供試柑橘之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.64-0.96。遺傳相似系數(shù)在0.64處，21份柑橘資源可以分成2類，即桔柚類和余下20份柑橘資源聚成1類。當以遺傳相似系數(shù)0.72為閾值可將供試的21份材料劃分為5組。聚類分析結果顯示同一類別的柑橘種質資源遺傳關系較近，往往劃分在同一組。本研究表明ISSR可有效揭示福州種質資源的遺傳多樣性、親緣關系和遺傳分化程度，為探討福州地區(qū)柑橘的適應性和生存力提供基礎數(shù)據，能夠及時為瀕危品種制定科學有效的保護方案并采取相應的措施。

4問題與展望

利用ISSR分子標記技術能有效地鑒定柑橘不同品種及分析種質資源的遺傳多樣性，但所需引物需要具有更強的專一性，為此在篩選引物時增加了試驗工作量;同時，需要一定時間摸索PCR擴增的最適反應條件;此外，ISSR分子標記呈顯性遺傳標記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型[26]。在計算遺傳相似系數(shù)時可能存在無法避免的偏差，有些長度剛好相等的條帶出現(xiàn)在同一個位置上，但并不一定來自基因組上的同一區(qū)域。因此，對柑橘分類的研究應該考慮各方面的影響因素綜合分析。今后柑橘遺傳圖譜研究中，可利用ISSR標記和其他分子標記技術聯(lián)合來共同構建，并可利用與目標質量性狀基因緊密連鎖的分子標記進行質量性狀選擇，如抗病性、抗蟲性和抗鹽性等。同時，充分利用ISSR分子標記進行柑橘種質資源的鑒定及新種質的創(chuàng)新，還應注重分子標記與豐富的傳統(tǒng)育種經驗相結合，提高柑橘在農產品市場上的競爭力。

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基金項目：福建省科技計劃項目“福桔種質資源的收集、保存、利用和創(chuàng)新”（2017N0060），“都市特色園藝作物種質資源保護與創(chuàng)新利用”（2016N3018）。

第一作者簡介：趙依杰，男，1970年出生，福建長樂人，研究員，碩士，研究方向：瓜果品種選育與栽培生理。通信地址：350018福州市倉山區(qū)城門石步275號福州市農業(yè)科學研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：zyjie1970@163.com。

通訊作者：胡章瓊，女，1974年出生，湖北公安人，副研究員，研究方向：果樹栽培與育種。通信地址：350018福州市倉山區(qū)城門石步275號福州市農業(yè)科學研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：549392473@qq.com。

收稿日期：2018-08-23，修回日期：2019-02-26。