許均華,張紅莉,賀 偉,鄧湘波,李 勇,劉冠瓊,徐文泱

(1.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 郴州 423000； 2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙 410111)

隨著我國(guó)人民物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對(duì)食用植物油的消費(fèi)需求量增長(zhǎng)強(qiáng)勁[1]。當(dāng)前植物油的主要生產(chǎn)工藝有壓榨法和浸出法。六號(hào)溶劑是食用植物油在浸出生產(chǎn)工藝中使用的主要萃取劑，它是一種低沸點(diǎn)的石油餾分，主要成分是C6～C8的烴類物質(zhì)。若長(zhǎng)期食用含該物質(zhì)超標(biāo)的食用植物油，消費(fèi)者會(huì)受到呼吸中樞麻痹、周圍神經(jīng)和造血功能損害等威脅[2]。加強(qiáng)對(duì)浸出毛油、成品油生產(chǎn)工藝中溶劑殘留量的監(jiān)測(cè)，不僅可以提升油脂的品質(zhì)，而且有利于創(chuàng)造更加安全的食品環(huán)境。

近年來(lái)，超聲波技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、快速、成本低以及獨(dú)特的物理和聲化學(xué)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在食品檢測(cè)和食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[3]。目前利用超聲波對(duì)植物油進(jìn)行提取的研究較多[4-6]。然而，關(guān)于植物油溶劑殘留量檢測(cè)方法的研究主要集中在優(yōu)化頂空條件上[7-8]。GB 5009.262—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中溶劑殘留量的測(cè)定》采用加熱溫度為60℃，平衡時(shí)間為30 min的頂空加熱進(jìn)樣法(HGC)。雖然檢測(cè)精度高，但是在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中存在耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)效率低、加熱溫度較高等問(wèn)題。因此，亟需建立一種快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的溶劑殘留量檢測(cè)方法。目前，鮮有利用超聲波與頂空技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行植物油溶劑殘留量快速檢測(cè)方法構(gòu)建的研究報(bào)道。

本研究擬利用超聲波的生熱、機(jī)械和空化等效應(yīng),采用超聲波振蕩平衡進(jìn)行前處理[9]，通過(guò)構(gòu)建響應(yīng)面法(RSM)[10-11]模型和遺傳算法-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(GA-ANN)模型[12-13]對(duì)超聲-頂空氣相色譜法(UV-HGC)測(cè)定植物油中六號(hào)溶劑殘留量的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，縮短頂空平衡時(shí)間，同時(shí)對(duì)實(shí)際檢測(cè)效果進(jìn)行了研究，以期為企業(yè)生產(chǎn)和基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展大規(guī)模檢驗(yàn)提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

六號(hào)溶劑標(biāo)準(zhǔn)品(溶劑為N,N-二甲基乙酰胺，質(zhì)量濃度10 mg/mL)，國(guó)家糧食局科學(xué)研究院；正庚烷(CAS:142-82-5)，HPLC級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；N，N-二甲基乙酰胺(CAS:127-19-5，DMAC)，分析純，上海金山經(jīng)緯化工有限公司；大豆油、菜籽油、稻米油、芝麻油、花生油、玉米油、橄欖油、葵花籽油，購(gòu)于郴州市本地市場(chǎng)(散裝植物油共80個(gè)樣品)和超市(品牌植物油共80個(gè)樣品)。

ML204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5～100 μL移液器，Eppendorf AG；KQ-700GTDV型高頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器；DHG-9140B電熱鼓風(fēng)干燥箱；AOC-5000 SHIMADZU型恒溫振蕩器，日本島津公司；GC-2010PLUS型氣相色譜儀、FID檢測(cè)器，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

HGC：稱量5.0 g(精確到0.01 g)基體植物油樣品(六號(hào)溶劑殘留量低于檢出限)于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，然后迅速向頂空進(jìn)樣瓶中加入正庚烷標(biāo)準(zhǔn)工作液(68 mg/mL)5 μL作為內(nèi)標(biāo)，用手輕搖后再加入25 μL六號(hào)溶劑標(biāo)準(zhǔn)品，輕微搖勻后得到含有50 mg/kg六號(hào)溶劑和68 mg/kg正庚烷內(nèi)標(biāo)的基體植物油待測(cè)樣，密封。保持頂空進(jìn)樣瓶直立，待分析。

UV-HGC：將1.2.1方法得到的基體植物油待測(cè)樣,于超聲波振蕩器處理一段時(shí)間，待分析。

1.2.2 色譜條件

HGC：HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣為氮?dú)?純度≥99.999%)，流速1 mL/min；色譜柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持3 min，然后以1℃/min的速率升溫至55℃，保持3 min，再以30℃/min的速率升溫至200℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度300℃；分流比100∶1；空氣流速300 mL/min；氫氣流速25 mL/min；進(jìn)樣量500 μL；頂空恒溫60℃,保持30 min。

UV-HGC：將1.2.2 HGC條件修改為頂空恒溫60℃,保持5 min，其余條件不變。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在UV-HGC方法中，固定條件為超聲功率500 W、超聲時(shí)間6 min、超聲溫度50℃、頂空平衡時(shí)間5 min，以色譜峰面積為指標(biāo)，考察其中一個(gè)因素時(shí)，其他因素條件不變。

在HGC方法中,固定頂空平衡時(shí)間為11 min，以色譜峰面積為指標(biāo)，對(duì)頂空溫度進(jìn)行考察。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018進(jìn)行單因素作圖；采用Design-Expert8.0軟件設(shè)計(jì)RSM，對(duì)每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)并進(jìn)行結(jié)果的顯著差異分析；采用MATLABR2016a構(gòu)建ANN模型及GA尋優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖1)

圖1 溫度、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)峰面積的影響

從圖1A可以看出，UV-HGC比HGC在相同溫度時(shí)，峰面積更大。隨著溫度升高，峰面積都顯著增大(P<0.05)，干擾峰逐漸增多，且到了70℃后峰面積上升趨勢(shì)趨于平緩。原因是油脂中所殘留的溶劑主要是C6～C8烷烴類的化合物，其沸點(diǎn)主要集中在60～90℃之間。另外各組分在頂空裝置中的平衡溫度與蒸汽壓直接相關(guān)，溫度、蒸汽壓、頂空氣體的濃度、分析靈敏度等因素成正相關(guān)關(guān)系。但是頂空進(jìn)樣時(shí)溶劑組分容易受過(guò)高的平衡溫度導(dǎo)致其冷凝,降低了密封橡膠的氣密性和進(jìn)樣精度。此外還會(huì)出現(xiàn)油脂基質(zhì)分解、水蒸氣產(chǎn)生、基線出現(xiàn)波動(dòng)等現(xiàn)象，影響溶劑殘留量測(cè)定。綜合上述原因，考慮到超聲與溫度的耦合作用，超聲溫度選擇40、50、60℃ 3個(gè)水平進(jìn)行RSM實(shí)驗(yàn)。

由圖1B可知，當(dāng)超聲功率增大，峰面積顯著增大(P<0.05)，靈敏度提高，到了600 W后峰面積上升趨勢(shì)趨于平緩，無(wú)顯著性變化(P>0.05)。由于超聲對(duì)油脂分子的攪拌及空穴作用增強(qiáng)，進(jìn)而使其擴(kuò)散層上的分子擴(kuò)散急劇加快，有利于六號(hào)溶劑的逸出，加之在50℃超聲溫度的耦合作用下，越來(lái)越多的六號(hào)溶劑組分相繼達(dá)到沸點(diǎn)，揮發(fā)到氣相中，達(dá)到氣相平衡?？紤]成本和實(shí)用性，選擇超聲功率為400、500、600 W 3個(gè)水平進(jìn)行RSM實(shí)驗(yàn)。

由圖1C可知，峰面積隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大(P<0.05)，超聲時(shí)間達(dá)到12 min后，峰面積變化不顯著(P>0.05)，表明氣液兩相之間基本達(dá)到平衡。由于平衡時(shí)間取決于被測(cè)組分分子從樣品基質(zhì)到氣相的擴(kuò)散速度，超聲溫度、超聲功率不同，平衡所需的時(shí)間也不同，故選擇超聲時(shí)間為3、6、9 min 3個(gè)水平進(jìn)行RSM實(shí)驗(yàn)。

2.2 RSM優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度為自變量，以峰面積為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲前處理六號(hào)溶劑的條件。RSM因素與水平見(jiàn)表1。RSM設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2，RSM方差分析見(jiàn)表3。

以A、B、C為自變量，峰面積(Y)為因變量，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)(3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到的回歸方程為:Y=15.94+5.43A+1.67B+4.90C+0.63AB-0.74AC-0.53BC-2.61A2-1.00B2-1.72C2。模型P<0.01,決定系數(shù)(R2)為0.891 4。失擬項(xiàng)P為0.063 3(P>0.05)、變異系數(shù)(CV)為6.23%、均方根誤差(RMSE)為0.785 6，失擬不顯著，說(shuō)明該模型擬合充分，效果較好。由表3可知，各因素對(duì)峰面積影響的主次順序?yàn)槌晻r(shí)間>超聲功率>超聲溫度。模型中一次項(xiàng)A、C為極顯著因素，二次項(xiàng)C2為顯著因素，A2為極顯著因素，表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系可以較好地被描述。但是各交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著(P>0.05)，說(shuō)明該模型的因素交互作用對(duì)峰面積影響均不顯著，不能很好地反映各因素之間的耦合作用。

表1 RSM因素與水平

表2 RSM設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 RSM方差分析

注：**差異極顯著，P<0.01；*差異顯著，P<0.05。

2.2.2 最佳條件的確定及驗(yàn)證

使用軟件Design-Expert8.0分析回歸方程得到最佳前處理?xiàng)l件為超聲功率484.98 W、超聲時(shí)間8.08 min、超聲溫度47.68℃，在此條件下峰面積的理論值為219 680 μV·s。考慮到實(shí)際可行性，將各實(shí)驗(yàn)條件修正為超聲功率490 W、超聲時(shí)間8 min、超聲溫度48℃，按照修正后的條件進(jìn)行可靠性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到峰面積平均值為201 260 μV·s，理論值和實(shí)驗(yàn)值相差9.15%。由此可知，采用RSM優(yōu)化超聲前處理所得到的回歸模型及最佳條件可靠。

2.3 ANN模型構(gòu)建結(jié)果

2.3.1 ANN模型及分析

通過(guò)MATLABR2016a軟件選取超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)變量作為網(wǎng)絡(luò)輸入層節(jié)點(diǎn)，并歸一化處理在0～1之間，峰面積作為輸出層節(jié)點(diǎn)，運(yùn)用反向傳播方法建立三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。tansig函數(shù)和purelin函數(shù)分別作為隱含層傳遞函數(shù)和輸出層傳遞函數(shù)，訓(xùn)練函數(shù)為trainlm函數(shù)，選用8個(gè)品種植物油共計(jì)160個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(每個(gè)樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn))做ANN模型訓(xùn)練(如圖2所示)，得到的輸入與輸出映射關(guān)系的網(wǎng)格，其初始種群為480。然后用測(cè)試樣本測(cè)試ANN模型擬合的效果，最終確定ANN模型結(jié)構(gòu)(如圖3所示)。并對(duì)模型的擬合精度和預(yù)測(cè)精度進(jìn)行評(píng)估。由圖2可知，經(jīng)過(guò)2次迭代后網(wǎng)絡(luò)收斂精度達(dá)到10-4，樣本訓(xùn)練能較快達(dá)到收斂。

圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程

圖3 超聲前處理六號(hào)溶劑的ANN模型

基于RSM實(shí)驗(yàn)條件(表2)所得數(shù)據(jù)(480組矩陣)作為樣本，使用trainlm算法對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練。為防止過(guò)度擬合，在保證訓(xùn)練精度的情況下，盡量減少中間隱含層數(shù)量，訓(xùn)練后比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)隱含層神經(jīng)元為8時(shí)，能對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確擬合。所以本實(shí)驗(yàn)選擇拓?fù)錁?gòu)為3-8-1的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)設(shè)置BP網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練參數(shù)(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)仿真次數(shù)為10 000，學(xué)習(xí)率為0.01，動(dòng)量因子為0.1，目標(biāo)誤差為0.000 1)，分別比較訓(xùn)練集和測(cè)試集與其對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)值，可知其吻合度較好，均方誤差符合預(yù)期設(shè)定(MSE=0.000 1)。

2.3.2 GA優(yōu)化及結(jié)果驗(yàn)證

用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)ANN模型進(jìn)行模擬優(yōu)化仿真，然后將訓(xùn)練完畢的較優(yōu)模型作為GA的擬合函數(shù)，通過(guò)MATLABR2016a軟件中GA遺傳算法工具箱將ANN建模和遺傳優(yōu)化算法結(jié)合，尋找輸入及輸出變量的最優(yōu)解。具體過(guò)程包括：采用二進(jìn)制編碼將各變量的參數(shù)集進(jìn)行編碼；將每代染色體種群設(shè)為20，最大進(jìn)化代數(shù)為10 000，雜交概率為0.8，變異概率為0.02；適應(yīng)度評(píng)價(jià)；判斷是否滿足終止條件，如不滿足則進(jìn)行循環(huán)，直到滿足條件；輸出遺傳算法得到最優(yōu)解。GA的迭代次數(shù)為100，采用浮點(diǎn)數(shù)編碼，個(gè)體長(zhǎng)度為1，優(yōu)化過(guò)程中個(gè)體最優(yōu)適應(yīng)度變化曲線見(jiàn)圖4。

圖4 適應(yīng)度曲線

由圖4可知，在進(jìn)化40代后達(dá)到最佳適應(yīng)度。此時(shí)其峰面積已達(dá)到最大值，隨后基本保持不變，經(jīng)GA對(duì)超聲前處理參數(shù)進(jìn)行全局尋優(yōu)，獲得的峰面積預(yù)測(cè)最大值為223 410 μV·s，其對(duì)應(yīng)的提取參數(shù)為超聲功率494.12 W、超聲時(shí)間7.12 min、超聲溫度49.34℃，考慮實(shí)際操作，將參數(shù)修正為超聲功率500 W、超聲時(shí)間7 min、超聲溫度50℃。用修正后的參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到峰面積平均值為210 870 μV·s。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相差5.95%，得到的峰面積高于RSM的。

2.3.3 RSM模型和GA-ANN模型的對(duì)比

按照RSM實(shí)驗(yàn)條件(表2)預(yù)測(cè)峰面積，對(duì)比峰面積的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，RSM和GA-ANN兩個(gè)模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值在Y=X直線上分布情況。根據(jù)預(yù)測(cè)值進(jìn)行計(jì)算，得出RSM和GA-ANN的均方根誤差(RMSE)、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEP)、R2分別為0.785 6、0.042 0、0.891 4和0.532 9、0.028 5、0.949 5。由此可知，GA-ANN模型擁有更大的R2和更小的RMSE、SEP，模型表現(xiàn)出較好的擬合能力以及預(yù)測(cè)能力。GA-ANN模型處理非線性問(wèn)題的能力比RSM更強(qiáng)大，RSM的原理是通過(guò)建立二次多項(xiàng)式模型，而對(duì)非線性關(guān)系的數(shù)據(jù)擬合能力相對(duì)較弱；GA-ANN模型是根據(jù)現(xiàn)有的矩陣向量進(jìn)行迭代計(jì)算，通過(guò)學(xué)習(xí)和存貯大量的輸入-輸出模式映射關(guān)系，建立預(yù)測(cè)模型，不像RSM模型預(yù)先需要給定函數(shù)。

圖5 對(duì)比峰面積的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值

2.4 經(jīng)UV-HGC前處理后的氣相色譜圖(見(jiàn)圖6)

注：1.2-甲基戊烷；2.3-甲基戊烷；3.正己烷；4.甲基環(huán)戊烷；5.環(huán)己烷；6.2，3-二甲基戊烷；7.正庚烷。

圖6 經(jīng)UV-HGC前處理后的氣相色譜圖

由圖6可知，經(jīng)過(guò)UV-HGC前處理后，植物油中的六號(hào)溶劑6個(gè)主峰與內(nèi)標(biāo)物(正庚烷)分離情況良好，且雜峰干擾少。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系及檢出限

以不同品種植物油為基體油，配制含內(nèi)標(biāo)的6種不同質(zhì)量濃度的六號(hào)溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照GA-ANN方法優(yōu)化的UV-HGC參數(shù)條件進(jìn)行測(cè)定。采用內(nèi)標(biāo)法定量，以六號(hào)溶劑中6個(gè)目標(biāo)組分的總峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y)對(duì)六號(hào)溶劑的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物正庚烷質(zhì)量濃度比值(x)進(jìn)行線性擬合，得到植物油的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)等。根據(jù)公式S/N≥3確定方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10確定方法的定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，方法的靈敏度滿足樣品的定量分析及GB 5009.262—2016的限量要求。

表4 植物油中六號(hào)溶劑殘留的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5.2 結(jié)果準(zhǔn)確度與儀器精密度

基體植物油經(jīng)過(guò)超聲波脫氣，得到空白植物油待測(cè)樣品，然后把植物油待測(cè)樣品依次準(zhǔn)確稱量10份，分別添加高(200 mg/kg)、中(50 mg/kg)、低(10 mg/kg)3種不同加標(biāo)量的六號(hào)溶劑標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)加標(biāo)量平行制備3份。其中留有1份不加標(biāo)準(zhǔn)品的植物油待測(cè)樣品作為空白對(duì)照組，計(jì)算加標(biāo)回收率及RSD。另外考察方法的精密度，植物油分別平行制備6份，添加中等加標(biāo)量的六號(hào)溶劑標(biāo)準(zhǔn)品，按UV-HGC 方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，在低、中、高3個(gè)水平下，測(cè)定植物油中六號(hào)溶劑殘留量的平均回收率分別為95.5%、98.6%、100.4%，RSD(n=9)不大于3.5%，準(zhǔn)確度滿足平均回收率在90%～110%范圍內(nèi)。植物油的精密度RSD(n=6)均不大于5%，與HGC(國(guó)標(biāo))法相比較，能達(dá)到國(guó)標(biāo)方法要求，具有較理想的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)顯著因素進(jìn)行篩選，并采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)構(gòu)建RSM模型和GA-ANN模型預(yù)測(cè)UV-HGC測(cè)定植物油中六號(hào)溶劑殘留量的前處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，在處理該非線性問(wèn)題時(shí)，GA-ANN模型比RSM模型具有更好的擬合和預(yù)測(cè)能力。最終采用GA-ANN優(yōu)化得到最佳超聲前處理?xiàng)l件為超聲功率500 W、超聲時(shí)間7 min、超聲溫度50℃,在此條件下檢測(cè)植物油中溶劑殘留得到的峰面積為210 870 μV·s。UV-HGC法平衡時(shí)間為(超聲前處理7 min，頂空平衡5 min)12 min。將該方法與國(guó)標(biāo)方法關(guān)鍵步驟進(jìn)行比較，結(jié)果表明，UV-HGC 法在達(dá)到國(guó)標(biāo)檢出限的基礎(chǔ)上縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率，達(dá)到了快速檢測(cè)的目的，更適用于植物油中六號(hào)溶劑殘留量的檢測(cè)。