李妲汨，姜興興，陳競男

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

植物甾醇是以環(huán)戊烷全氫菲為基本骨架的天然活性化合物[1]，主要存在于谷物、豆類、堅(jiān)果和種子中[2-3]，通常以游離態(tài)、酯態(tài)、配糖等形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇能夠顯著降低人體血清中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度，有效預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生[4-5]。食品工業(yè)中的植物甾醇主要從油脂精煉過程中的脫臭餾出物和工業(yè)生產(chǎn)的下腳浮油中獲得[6-7]，主要為游離態(tài)植物甾醇。游離態(tài)植物甾醇由于C-7位羥基的存在，溶解性較差，生物利用度有限[8]。因此，常通過合成甾醇酯對(duì)其進(jìn)行改性[9]。

油酸屬于單不飽和脂肪酸，具有降血脂等生理功能，但油酸在空氣中易氧化，將其與植物甾醇結(jié)合，不僅能夠改善植物甾醇的油溶性，而且也能夠增加油酸的穩(wěn)定性[10]。將植物甾醇與油酸進(jìn)行酯化可以充分發(fā)揮植物甾醇和油酸的生理功效，得到功能特性良好的植物甾醇酯。

合成甾醇酯的方法主要有化學(xué)法和酶法，化學(xué)法具有反應(yīng)時(shí)間短、酯化率高等優(yōu)點(diǎn)，但反應(yīng)溫度較高，會(huì)有副產(chǎn)物伴隨產(chǎn)生；酶法合成反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、易于分離純化，但是成本過高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。陳茂彬等[11]采用化學(xué)法合成植物甾醇油酸酯，在最佳反應(yīng)條件下合成產(chǎn)物的酯化率為84.3%，產(chǎn)品經(jīng)精制后純度可達(dá)到90.2%。潘麗軍等[12]以Candidarugosa脂肪酶為催化劑，采用微波輔助酶法合成植物甾醇油酸酯。在最佳工藝條件下合成產(chǎn)物的酯化率為75.26%，經(jīng)分離純化后產(chǎn)物的純度可達(dá)到91.19%。

目前，研究者大多利用氣相色譜法(GC)對(duì)植物甾醇酯進(jìn)行定性定量分析。GC雖然分辨率高，但是樣品前處理須經(jīng)皂化、固相萃取、薄層色譜分離、硅烷化試劑衍生等步驟，操作煩瑣。液相色譜法(HPLC)是功能食品中功效成分測定應(yīng)用最廣的分析手段，具有選擇性高、分析速度快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于甾醇酯合成工藝優(yōu)化時(shí)，產(chǎn)品無需進(jìn)行前處理可直接進(jìn)行分析。因此，本實(shí)驗(yàn)采用油酸與大豆甾醇在脂肪酶的催化下合成大豆甾醇油酸酯，并采用高效液相色譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳的合成條件，以期為植物甾醇資源的高值化利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆甾醇(純度95%，其中β-谷甾醇45%、菜油甾醇26%、豆甾醇24%、菜籽甾醇4%)，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；油酸，阿拉丁試劑(上海)有限公司；正己烷(色譜純)，賽摩飛世爾科技(中國)有限公司；環(huán)己烷、正丁醇、正己烷、正庚烷、異辛烷，均為分析純；N435脂肪酶、CRL脂肪酶、CALB脂肪酶、CALA脂肪酶，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；TL100L脂肪酶、RMIM脂肪酶，丹麥諾維信公司；膽固醇油酸酯標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

2695高效液相色譜儀(HPLC)，美國Waters公司；電子天平；IKA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；水浴恒溫振蕩器；傅里葉紅外光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆甾醇油酸酯的合成

在25 mL反應(yīng)管中加入109.0 mg大豆甾醇(1 mmol)，一定量的油酸、脂肪酶催化劑以及10 mL有機(jī)溶劑，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間，即得到含有大豆甾醇油酸酯的反應(yīng)混合物。

1.2.2 大豆甾醇油酸酯定量分析以及產(chǎn)率計(jì)算

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g膽固醇油酸酯，用正己烷配制成50、100、200、500、1 000 μg/mL不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，待高效液相色譜分析。以膽固醇油酸酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制膽固醇油酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 高效液相色譜分析條件

硅膠色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；采用等度洗脫，流動(dòng)相為正己烷-異丙醇(體積比20∶1)，流速0.8 mL/min；紫外檢測波長210 nm。

1.2.2.3 樣品測定以及大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的計(jì)算

將1.2.1反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，從中取出100 μL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，再用高效液相色譜檢測。通過1.2.2.1膽固醇油酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大豆甾醇油酸酯的質(zhì)量，按下式計(jì)算大豆甾醇油酸酯的產(chǎn)率。

產(chǎn)率=反應(yīng)后大豆甾醇油酸酯的實(shí)際質(zhì)量/大豆甾醇油酸酯的理論質(zhì)量×100%

1.2.3 紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀，全反射光譜測定法(ATR)進(jìn)行分析。分析條件：采樣32次，掃描范圍4 500～400 cm-1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆甾醇油酸酯的色譜分析

以膽固醇油酸酯作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)按照1.2.1方法合成的大豆甾醇油酸酯進(jìn)行定性和定量分析，所得高效液相色譜圖見圖1。由圖1可見，膽固醇油酸酯的出峰時(shí)間約為4 min，大豆甾醇油酸酯的出峰時(shí)間也約為4 min，合成的大豆甾醇油酸酯粗產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，說明合成產(chǎn)物為大豆甾醇油酸酯。

膽固醇油酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2 685.8x，R2=0.999 7，說明線性方程擬合效果良好，可以用于大豆甾醇油酸酯的定量分析。

圖1 膽固醇油酸酯和大豆甾醇油酸酯的高效液相色譜圖

2.2 大豆甾醇油酸酯合成的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 脂肪酶種類的影響

研究發(fā)現(xiàn)[13]，不同脂肪酶對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響有顯著的差別。在大豆甾醇109.0 mg、油酸83.1 mg(油酸與大豆甾醇的摩爾比為1∶1)、催化劑脂肪酶用量8%(以大豆甾醇和油酸的總質(zhì)量計(jì))、正丁醇10 mL、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間24 h條件下，選取不同的脂肪酶為催化劑，考察脂肪酶種類對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 脂肪酶種類對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

由圖2可見，N435脂肪酶為催化劑時(shí)，大豆甾醇油酸酯的產(chǎn)率最高，達(dá)到(63.18±1.4)%，其次為RMIM脂肪酶，大豆甾醇油酸酯的產(chǎn)率為(54.87±1.63)%，這兩種脂肪酶的產(chǎn)率均顯著高于其他脂肪酶的。這是因?yàn)镹435脂肪酶和RMIM脂肪酶均為固定化脂肪酶，催化能力較強(qiáng)。因此，選擇N435脂肪酶作為催化用酶。

2.2.2 溶劑種類對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

不同反應(yīng)溶劑具有不同的疏水性，疏水性會(huì)影響脂肪酶的活性和穩(wěn)定性，并對(duì)底物溶解性有一定的影響，因此溶劑種類的選取十分關(guān)鍵[14]。以N435脂肪酶為催化劑，其他條件同2.2.1，改變有機(jī)溶劑種類，考察有機(jī)溶劑種類對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 有機(jī)溶劑種類對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

由圖3可見，異辛烷為溶劑時(shí)，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率最高，達(dá)到了(82.14±1.12)%，這可能是因?yàn)楫愋镣榈氖杷宰钸m合于反應(yīng)底物的溶解和脂肪酶活性的激發(fā)。環(huán)己烷為溶劑時(shí)，大豆甾醇油酸酯的產(chǎn)率最低，這可能是由于環(huán)己烷的疏水性最弱，反應(yīng)底物溶解度低，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。因此，選取有機(jī)溶劑異辛烷來促進(jìn)合成反應(yīng)。

2.2.3 醇酸摩爾比對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

以異辛烷為溶劑，其他條件同2.2.2，在大豆甾醇用量109.0 mg時(shí)通過改變醇酸摩爾比來確定油酸用量，考察醇酸摩爾比對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 醇酸摩爾比對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

由圖4可見，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率隨著醇酸摩爾比的增加先急劇增大后有下降趨勢，醇酸摩爾比從1∶0.5增至1∶1時(shí)，產(chǎn)率由(47.00±0.33)%升到(84.74±0.23)%，醇酸摩爾比從1∶2增加至1∶4時(shí)，產(chǎn)率從(82.94±1.53)%降至(78.08±1.03)%。這是因?yàn)檫^量的油酸不利于甾醇的酯化，使反應(yīng)朝著反方向進(jìn)行；同時(shí)，在酯化反應(yīng)中，過量的油酸與酶對(duì)于底物存在競爭性抑制關(guān)系[15]。在實(shí)際生產(chǎn)中油酸過量太多不利于最終產(chǎn)品的分離提純[16]。為了節(jié)約成本，選擇最佳醇酸摩爾比為1∶1。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

以異辛烷為溶劑，其他條件同2.2.2，改變反應(yīng)溫度，考察反應(yīng)溫度對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

由圖5可見，在20～40℃時(shí)，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率隨著反應(yīng)溫度的升高顯著增加，這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)溫度的升高，N435脂肪酶逐漸被激活，催化作用逐漸增強(qiáng)，同時(shí)溫度升高使底物充分溶解，酶與底物接觸面積增大，催化作用增強(qiáng)。反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，產(chǎn)率與40℃時(shí)無顯著差異。為節(jié)約成本，選擇最佳反應(yīng)溫度為40℃。

2.2.5 脂肪酶用量對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

以異辛烷為溶劑，其他條件同2.2.2，改變脂肪酶用量，考察N435脂肪酶用量對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 脂肪酶用量對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

由圖6可以看出，隨著脂肪酶用量的增加，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率先升高后降低，在脂肪酶用量為8%時(shí)，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率最高，為(84.74±0.23)%。這是因?yàn)殡S著脂肪酶用量的增加，會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，但酶過量后會(huì)聚集，與反應(yīng)物的接觸面積相對(duì)減少，產(chǎn)率降低[17]。因此，選擇最佳N435脂肪酶用量為8%。

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

以異辛烷為溶劑，其他條件同2.2.2，改變反應(yīng)時(shí)間，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可見：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率先上升后下降，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從6 h延長至24 h時(shí)，產(chǎn)率從(64.58±0.2)%升高至(84.74±0.21)%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從24 h延長至30 h時(shí)，產(chǎn)率從(84.74±0.23)%下降至(64.49±2.02)%。這可能是由于在24 h內(nèi)，底物反應(yīng)充分，脂肪酶的催化效率較高，反應(yīng)正向進(jìn)行，產(chǎn)率逐漸升高；隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長，脂肪酶的穩(wěn)定性降低，同時(shí)酯化反應(yīng)存在逆反應(yīng)，隨著產(chǎn)物的增加，反應(yīng)生成的酯會(huì)被水解，使產(chǎn)率降低[18]。因此，選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為24 h。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率的影響

2.3 大豆甾醇油酸酯合成的正交實(shí)驗(yàn)

以N435脂肪酶為催化劑，異辛烷用量10 mL(大豆甾醇為1 mmol時(shí))，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，以植物甾醇油酸酯產(chǎn)率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2和表3可知，各因素對(duì)大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率影響大小依次為B>A>D>C，最佳工藝組合為A2B3C1D3，即醇酸摩爾比1∶1，脂肪酶用量6%，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間30 h。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率為86.51%。

表3 方差分析

2.4 大豆甾醇油酸酯的表征

將最佳條件下反應(yīng)得到的大豆甾醇油酸酯反應(yīng)混合物冷卻后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再參考Weber等[19]的純化方法，經(jīng)柱層析純化，可得到純度為95.13%的大豆甾醇油酸酯。采用紅外光譜法對(duì)大豆甾醇和純化的大豆甾醇油酸酯結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖8、圖9所示。

圖8 大豆甾醇的紅外光譜圖

圖9 大豆甾醇油酸酯的紅外光譜圖

3 結(jié) 論

采用酶法合成大豆甾醇油酸酯，采用高效液相色譜對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行定性定量分析，通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)得到大豆甾醇油酸酯的最佳合成工藝條件為催化劑N435脂肪酶用量(以大豆甾醇和油酸的總質(zhì)量計(jì))6%、醇酸摩爾比1∶1、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間30 h、異辛烷用量10 mL(大豆甾醇為1 mmol時(shí))。在最佳反應(yīng)條件下，大豆甾醇油酸酯產(chǎn)率為86.51%。產(chǎn)品紅外光譜表征說明獲得了目標(biāo)產(chǎn)物。